Administración de ácidos nucleicos funcionales a células de mamífero a través de minicélulas intactas obtenidas a partir de bacterias.

Una composición que comprende (a) una minicélula intacta, obtenida a partir de bacterias que contiene una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprende un segmento que codifica una molécula de ácido nucleico funcional,

comprendiendo además dicha minicélula un ligando biespecífico, en donde dicho ligando biespecífico tiene especificidad tanto hacia un componente de la superficie sobre la minicélula como hacia un componente de la superficie sobre una célula de mamífero no fagocítica; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma, en donde dicha molécula de ácido nucleico funcional se dirige al gen o al transcrito de una proteína que contribuye a la resistencia a un fármaco quimioterapéutico.

Administración de ácidos nucleicos funcionales a células de mamífero a través de minicélulas intactas obtenidas a partir de bacterias

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a iniciativas en curso para lograr una administración eficaz de ácidos nucleicos funcionales a células de mamíferos. Más específicamente, la invención se refiere al uso de vectores de minicélulas bacterianas para entregar ácidos nucleicos funcionales a células de mamífero. La invención es especialmente útil para eliminar la resistencia a los fármacos, principalmente en el contexto de una terapia contra el cáncer y el SIDA, para favorecer la apoptosis y para contrarrestar la neoplasia en células diana.

Avances recientes han puesto de manifiesto una variedad de técnicas para introducir ácidos nucleicos funcionales dentro de células. Por ejemplo, métodos de transfección basados en liposomas pueden entregar ácidos nucleicos producidos de forma exógena. Sin embargo, tal metodología exógena tiene el inconveniente de efectuar solo una inhibición transitoria de una diana. Además, los liposomas son inestables in vivo. Como alternativa a la administración de ácidos nucleicos producidos de forma exógena, los vectores pueden entregar plásmidos que codifican ácidos nucleicos funcionales, los cuales son producidos de forma endógena. Sin embargo, los vectores víricos útiles empleados actualmente para este propósito, plantean problemas graves de seguridad. Problemas a modo ilustrativo incluyen la recombinación con virus de tipo silvestre, un potencial de inserción y oncogénico, inmunosupresión inducida por el virus, capacidad limitada de los vectores víricos para transportar grandes segmentos de ADN, restablecimiento de la virulencia de virus atenuados, dificultades para preparar y distribuir virus recombinantes, una estabilidad reducida y reacciones adversas, tales como una respuesta inflamatoria, causada por una inmunidad existente. Una metodología que evitara estos problemas ofrecería un beneficio significativo para hacer la entrega de ácidos nucleicos funcionales más segura y eficaz.

Un método eficaz para la administración de ácidos nucleicos funcionales sería particularmente beneficioso para anular la resistencia a los fármacos. Las células de mamífero emplean una variedad de procesos biológicos para resistir a los fármacos, lo que plantea un obstáculo importante para el éxito del tratamiento del cáncer. Del mismo modo, la resistencia a los fármacos limita la eficacia del tratamiento del VIH, especialmente de una terapia anti- retrovírica de gran actividad (TARGA) que se basa en una combinación de inhibidores nucleósidos de la transcripta- sa inversa (INTIs) e Inhibidores de la proteasa (IPs) o un inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa (INNTI).

La resistencia clínica a la quimioterapia de un tumor puede ser intrínseca o adquirida. Una resistencia intrínseca existe en el momento del diagnóstico en tumores que no responden a la quimioterapia de primera línea. La resistencia adquirida se produce en tumores que pueden responder bien al tratamiento inicial, pero que presentan un fenotipo resistente después de una recidiva. Tales tumores adquieren resistencia tanto frente a fármacos utilizados previamente como a nuevos fármacos, Incluidos fármacos con estructuras y mecanismos de acción diferentes. El término MDR (resistencia a múltiples fármacos, del inglés "multldrug resistance") describe este fenómeno en el que las células tumorales se vuelven resistentes de forma cruzada a varios fármacos que no están relacionados estructuralmente, después de la exposición a un solo fármaco.

Los mecanismos de resistencia a múltiples fármacos son complejos y multlfactorlales, debido en gran parte al alto nivel de Inestabilidad genómlca y a mutaciones en las células cancerosas. Ejemplos de mecanismos son la inactivación de fármacos, extrusión de fármacos por medio de bombas de la membrana celular, disminución de la entrada de fármacos, mutaciones de dianas de fármacos y fallo para iniciar la apoptosis (Bredel, 2001; Chen et al., 2001; Whlte and McCubrey, 2001; Sun et al., 2001).

La extrusión de fármacos es particularmente común, y puede ser el resultado de la hlperexpresión de proteínas asociadas a la membrana que bombean fármacos desde el medio intracelular al extracelular. Tales bombas son frecuentemente miembros de la superfamilia de transportadores ABC (casete que se une a ATP) (Doige et al., 1993). La gllcoproteína P (Pgp) es un ejemplo de las mismas, y es un importante contribuyente a la MDR en una variedad de células cancerosas (Endicott et al., 1989; Lltman et al., 2001). Otros ejemplos incluyen la proteína asociada a la MDR (MRP; Colé et al., 1992), la proteína de resistencia del cáncer de mama (BCRP; Litman et al., 2000) y la proteína relacionada con la resistencia pulmonar (LRP; una proteína principal de bóveda; Scheffer et al., 2000). Otras proteínas transportadoras de múltiples fármacos también se han identificado en las células cancerosas (Got- tesman ef al., 2002) y en microorganismos patógenos (Van Bambeke et al., 2000).

La resistencia a la apoptosis (muerte celular programada) de las células tumorales inducida por agentes citotóxicos y radiación (Sellers y Fisher, 1999), es otro mecanismo común. Este mecanismo implica con frecuencia la hiperexpre- slón de proteínas antl-apoptóticas, como la proteína 2 de leucemia de linfocitos B (Bcl-2), Bcl-XL, Bcl-W, A1/Bf11, Mcl-1 y las mutaciones en la proteína p53. Aunque sigue siendo difícil comprender con precisión cómo proteínas del tipo Bcl-2 ejercen sus efectos anti-apoptóticos, las proteínas se hiperexpresan en muchos tipos de cáncer incluyendo el cáncer colorrectal, de próstata y de mama (Hanada, ef al., 1995; Bakhshi et al., 1985; Wang et al., 1996). El aumento de la expresión del factor de transcripción del factor nuclear kappa B (NF-kB) también es un mecanismo importante de las células tumorales para adquirir resistencia a la quimioterapia (Wang et al., 1999).

Se han identificado fármacos para contrarrestar la MDR, tales como fármacos que bloquean la acción de la glicopro- teína P (List et al., 1993; Miller et al., 1991; Wishart et al., 1992). Muchos de estos fármacos eran ineficaces en ensayos clínicos, sin embargo, debido a que se unen al plasma de pacientes, no podían llegara su destino (Ayesh et al., 1996a; Broxterman et al., 1987; Lehnert et al., 1996) y eran tóxicos para las células normales. El uso de ácidos nucleicos funcionales para contrarrestar la MDR también se ha intentado. Sin embargo, como se ha señalado anteriormente, los vectores existentes para este propósito son inestables o tóxicos, o plantean otros problemas graves de seguridad que impiden su uso en seres humanos (Sioud, 2004).

El documento WO 02/17852 A da a conocer una composición farmacéutica que comprende un nucleótido antisentido que se dirige a bcl-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El documento US 2003/203481 A1 da a conocer minicélulas obtenidas a partir de bacterias para la entrega de compuestos a células de mamífero, y sugiere el uso de las minicélulas para el tratamiento del cáncer, incluyendo la entrega de oligonucleótidos antisentido, ribozimas o fármacos de molécula pequeña, y sugiere además el uso de un resto de direccionamiento para la entrega específica a las células diana.

El documento WO 03/033519 A da a conocer minicélulas obtenidas a partir de bacterias para la entrega de compuestos a células de mamífero.

Por consiguiente, existe una necesidad actual de herramientas y métodos para la entrega de ácidos nucleicos funcionales que reduzcan la resistencia a los fármacos, favorezcan la apoptosis y contrarresten la neoplasia en células diana.

Compendio de la invención

Para hacer frente a estas y otras necesidades, la presente invención proporciona, en un aspecto, una composición que comprende (a) una minicélula intacta obtenida a partir de bacterias que contiene una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprende un segmento que codifica una molécula de ácido nucleico funcional, comprendiendo además dicha minicélula un ligando biespecífico, en donde dicho ligando biespecífico tiene especificidad tanto hacia un componente de la superficie en la minicélula como hacia un componente de la superficie en una célula de mamífero no fagocítica; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma, en donde dicha molécula de ácido nucleico funcional se dirige al gen o al transcrito de una proteína que contribuye a la resistencia a un fármaco quimioterapéutico.

En otro aspecto, la invención proporciona una minicélula intacta obtenida a partir de bacterias... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende (a) una minicélula intacta, obtenida a partir de bacterias que contiene una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprende un segmento que codifica una molécula de ácido nucleico funcional, comprendiendo además dicha minicélula un ligando biespecífico, en donde dicho ligando biespecífico tiene especificidad tanto hacia un componente de la superficie sobre la minicélula como hacia un componente de la superficie sobre una célula de mamífero no fagocítica; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma, en donde dicha molécula de ácido nucleico funcional se dirige al gen o al transcrito de una proteína que contribuye a la resistencia a un fármaco qulmloterapéutico.

2. La composición según la reivindicación 1, que comprende además un fármaco quimioterapéutico frente al cual el ácido nucleico funcional disminuye dicha resistencia a los fármacos.

3. Una minicélula Intacta obtenida a partir de bacterias que contiene una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprende un segmento que codifica una molécula de ácido nucleico funcional, en donde la molécula de ácido nucleico funcional se dirige a un gen o a un transcrito de una proteína que favorece la resistencia a un fármaco quimioterapéutico, comprendiendo además dicha minicélula un ligando biespecífico, teniendo dicho ligando biespecífico especificidad tanto hacia un componente de la superficie sobre la minicélula como hacia un componente de la superficie sobre una célula de mamífero no fagocítica; para uso como un medicamento.

4. Una minicélula intacta obtenida a partir de bacterias que contiene una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprende un segmento que codifica una molécula de ácido nucleico funcional, en donde la molécula de ácido nucleico funcional se dirige a un gen o a un transcrito de una proteína que favorece la resistencia a un fármaco quimioterapéutico, comprendiendo además dicha minicélula un ligando biespecífico, teniendo dicho ligando biespecífico especificidad tanto hacia un componente de la superficie sobre la minicélula como hacia un componente de la superficie sobre una célula de mamífero no fagocítica; para uso en el tratamiento de una enfermedad resistente a dicho fármaco quimioterapéutico, en donde dicha minicélula Intacta se administra de forma simultánea o consecutiva a dicho fármaco quimioterapéutico para permitir que el ácido nucleico funcional disminuya la resistencia a dicho fármaco quimioterapéutico.

5. La minicélula intacta obtenida a partir de bacterias según la reivindicación 4 para uso en el tratamiento de una enfermedad según la reivindicación 4, en donde dicho fármaco quimioterapéutico y dicha minicélula se administran de forma consecutiva, en cualquier orden.

6. La minicélula intacta obtenida a partir de bacterias según la reivindicación 4 para uso en el tratamiento de una enfermedad según la reivindicación 4, en donde dicho fármaco quimioterapéutico se administra después de dicha minicélula.

7. La minicélula intacta obtenida a partir de bacterias según la reivindicación 4 para uso en el tratamiento de una enfermedad según la reivindicación 4, en donde dicho fármaco quimioterapéutico y dicha minicélula se administran simultáneamente.

8. La minicélula Intacta obtenida a partir de bacterias según la reivindicación 4 para uso en el tratamiento de una enfermedad según la reivindicación 4, en donde dicha enfermedad resistente a dicho fármaco quimioterapéutico se selecciona a partir de la lista que consiste en cáncer, SIDA y tuberculosis.

9. La minicélula Intacta obtenida a partir de bacterias para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en donde dicho ligando biespecífico se selecciona a partir de la lista que consiste en receptores, enzimas, péptidos de unión, proteínas de fuslón/quiméricas y moléculas pequeñas.

10. La minicélula intacta obtenida a partir de bacterias para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, para administrar al menos una vez a la semana durante varias semanas hasta varios meses.

11. Un fármaco quimioterapéutico para uso en el tratamiento de una afección maligna resistente a los fármacos, en donde una minicélula intacta obtenida a partir de bacterias que contiene una molécula de ácido nucleico funcional o un plásmido que comprende un segmento que codifica una molécula de ácido nucleico funcional, en donde la molécula de ácido nucleico funcional se dirige al gen o al transcrito de una proteína que favorece la resistencia a dicho fármaco quimioterapéutico, comprendiendo además dicha minicélula un ligando biespecífico, teniendo dicho ligando biespecífico especificidad tanto hacia un componente de la superficie sobre la minicélula como hacia un componente de la superficie sobre una célula de mamífero no fagocítica, se administra de forma simultánea o consecutiva a dicho fármaco quimioterapéutico para permitir que el ácido nucleico funcional disminuya la resistencia a dicho fármaco quimioterapéutico.

12. El fármaco quimioterapéutico según la reivindicación 11 para uso en el tratamiento de una enfermedad según la reivindicación 11, en donde dicho fármaco quimioterapéutico y dicha minicélula se administran de forma consecutiva, en cualquier orden.

13. El fármaco quimioterapéutico según la reivindicación 11 para uso en el tratamiento de una enfermedad

según la reivindicación 11, en donde dicho fármaco quimioterapéutico se administra después de dicha minicélula.

14. El fármaco quimioterapéutico según la reivindicación 11 para uso en el tratamiento de una enfermedad según la reivindicación 11, en donde dicho fármaco quimioterapéutico y dicha minicélula se administran simultáneamente.

15. El fármaco quimioterapéutico según la reivindicación 11 para uso en el tratamiento de una enfermedad

según la reivindicación 11, en donde dicha enfermedad resistente a dicho fármaco quimioterapéutico se selecciona a partir de la lista que consiste en cáncer, SIDA y tuberculosis.

16. El fármaco quimioterapéutico según cualquiera de las reivindicaciones 11-15 para uso en el tratamiento de una enfermedad según la reivindicación 11, en donde dicho ligando biespecífico se selecciona a partir de la lista que

consiste en receptores, enzimas, péptidos de unión, proteínas de fusión/ quiméricas y moléculas pequeñas.

17. El fármaco quimioterapéutico según cualquiera de las reivindicaciones 11-16 para uso en el tratamiento de una enfermedad según la reivindicación 11, para administrar al menos una vez a la semana durante varias semanas hasta varios meses.