Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias.

Una composición de origen no natural u obtenida por ingeniería que comprende:

una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNchi) del sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas (CRISPR)-(Cas) asociado a CRISPR (CRISPR-Cas), en donde la secuencia de polinucleótidos comprende

(a) una secuencia guía con entre 10 - 30 nucleótidos de longitud, capaz de hibridarse a una secuencia diana en una célula eucariota,

(b) una secuencia de emparejamiento de tracr, y

(c) una secuencia de ARNtracr en la que (a), (b) y (c) se colocan en una orientación de 5' a 3', en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento de tracr se hibrida a la secuencia de ARNtracr y la secuencia guía dirige la unión específica de secuencias de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, en la que el complejo de CRISPR comprende una proteína Cas9 de Tipo II que forma complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento de tracr que se hibrida a la secuencia de ARNtracr,

en la que la secuencia de ARNtracr tiene una longitud de 50 o más nucleótidos.

Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias Campo de la invención La presente divulgación se refiere por lo general a sistemas, métodos y composiciones usadas para el control de la expresión genética que implican la orientación de secuencias, tal como perturbación del genoma o corrección de genes, que puede usar sistemas vector relacionados con Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas (CRISPR) y componentes de los mismos.

Declaración en cuanto a investigación patrocinada federalmente La presente invención se realizó con apoyo del gobierno otorgado por los National Institutes of Health, NIH Pioneer Award DP1MH100706. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Antecedentes de la invención Los recientes avances en técnicas de secuenciación del genoma y métodos de análisis han acelerado significativamente la capacidad de catalogar y realizar mapas de los factores genéticos asociados a una amplia gama de funciones biológicas y enfermedades. Se necesitan tecnologías de orientación del genoma precisas para permitir ingeniería inversa sistemática de las variaciones genéticas causales al permitir la alteración selectiva de elementos genéticos individuales, así como para avanzar en aplicaciones de biología sintética, biotecnológicas, y médicas. Aunque hay disponibilidad de técnicas para corregir el genoma tales como los dedos de cinc diseñadores, efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) , o meganucleasas de alojamiento para producir alteraciones del genoma dirigidas, sigue habiendo una necesidad de nuevas tecnologías de ingeniería del genoma que sean asequibles, fáciles de instalar, escalables, y susceptibles de dirección a múltiples posiciones dentro del genoma eucariota.

Sumario de la invención Existe una necesidad urgente de sistemas alternativos y técnicas para orientación de secuencias con una amplia gama de aplicaciones. La presente invención aborda esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas. El CRISPR/Cas o el sistema CRISPR-Cas (ambos términos se usan indistintamente a través de la presente solicitud) no requiere la generación de proteínas modificadas para dirigir secuencias específicas sino que más bien una sola enzima Cas se penetrara más mediante una molécula de ARN corto para reconocer una diana de ADN específica, en otras palabras, la enzima Cas se puede reclutar a una diana de ADN especifica usando dicha molécula de ARN corta. La adición del sistema CRISPR-Cas al repertorio de técnicas de secuenciación y métodos de análisis del genoma de simplificar de forma significativa la metodología y acelerar la capacidad para catalogar y formar mapas de factores genéticos asociados a un intervalo diverso de funciones biológicas y enfermedades. Para usar el sistema CRISPR-Cas en forma eficaz para corregir el genoma sin efectos perjudiciales, es fundamental entender aspectos de ingeniería y optimización de estas herramientas de ingeniería del genoma, que son aspectos de la invención que se reivindica.

En un aspecto, la divulgación proporciona un sistema vector que comprende uno o más vectores. En algunas realizaciones, el sistema comprende: (a) un primer elemento de regulación unido operativamente a una secuencia de emparejamiento de tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una o más secuencias guía cadena arriba de la secuencia de emparejamiento de tracr, en el que, cuando se expresa, la secuencia guía dirige la unión específica de secuencias de un complejo de CRISPR a una secuencia diana en una célula, por ejemplo, célula eucariota, en la que el complejo de CRISPR comprende una enzima de CRISPR que forma complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento de tracr que se hibrida a la secuencia de tracr; y (b) un segundo elemento de regulación unido de forma operativa a una secuencia que codifica enzimas que codifican dicha enzima de CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear; en el que los componentes (a) y (b) se ubican en los mismos o diferentes vectores del sistema. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende adicionalmente la secuencia de tracr cadena abajo de la secuencia de emparejamiento de tracr bajo el control del primer elemento de regulación. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende adicionalmente dos o más secuencias guía unidas de forma operativa al primer elemento de regulación, en el que, cuando se expresan, cada una de las dos o más secuencias guía dirige la unión específica de secuencias de un complejo de CRISP a una secuencia diana diferente en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el sistema comprende la secuencia de tracr bajo el control de un tercer elemento de regulación, tal como un promotor de la polimerasa III. En algunas realizaciones, la secuencia de tracr presenta una complementariedad de secuencias de al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, o un 99 % a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejamiento de tracr cuando se alinea de forma óptima. En algunas realizaciones, el complejo de CRISPR comprende una o más secuencias de localización nuclear de resistencia para conducir la acumulación de dicho complejo de CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. Sin desear quedar ligado por la teoría, se cree que una secuencia de localización nuclear no es necesaria para la actividad del complejo de

CRISPR en eucariotas, pero que la inclusión de tales secuencias aumenta la actividad del sistema, especialmente para dirigir las moléculas de ácido nucleico en el núcleo. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR es una enzima del sistema de CRISPR de tipo II. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 de S. pneumoniae, S. pyogenes, o S. thermophilus, y puede incluir Cas9 mutada derivada de estos organismos. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR tiene optimizado el codón para expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la enzima de CRISPR carece de actividad de escisión de hebras de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento de regulación es un promotor de la polimerasa III. En algunas realizaciones, el segundo elemento de regulación es un promotor de la polimerasa II. En algunas realizaciones, la secuencia guía tiene al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleótidos, o entre 10-30, o entre 15-25, o entre 15-20 nucleótidos de longitud. En general, y a través de la presente memoria descriptiva, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico a que se ha unido. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias, o parcialmente bicatenarias; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno con más extremos libres, sin extremos libres (por ejemplo, circular) ; moléculas de ácido nucleico que comprenden ARN, ARN, o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un " plásmido", que se refiere a un lazo de ADN bicatenario circular en el que se pueden insertar segmentos adicionales de ADN, tal como mediante técnicas de clonación molecular convencionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que están presentes en el vector secuencias de ADN o ARN derivadas por vía viral para almacenarse en un virus (por ejemplo, retrovirus, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus, adenovirus de replicación defectuosa, y virus adeno-asociados) . Los vectores virales también incluyen polinucleótidos portados por un virus para transfección en una célula anfitriona. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula anfitriona en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) se integran en el genoma de una célula anfitriona después de la introducción en la célula anfitriona, y de este modo se replican junto con el genoma anfitrión. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se unen de forma operativa. En el presente documento tales vectores se denominan "vectores de expresión". Los vectores de expresión comunes de utilidad en técnicas de ADN recombinante se presentan a menudo en forma de plásmidos.

Los vectores de expresión recombinante pueden comprender un ácido nucleico en una forma adecuada... [Seguir leyendo]

1. Una composición de origen no natural u obtenida por ingeniería que comprende:

una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNchi) del sistema de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas (CRISPR) - (Cas) asociado a CRISPR (CRISPR-Cas) , en donde la secuencia de polinucleótidos comprende

(a) una secuencia guía con entr.

10. 30 nucleótidos de longitud, capaz de hibridarse a una secuencia diana en una célula eucariota,

(b) una secuencia de emparejamiento de tracr, y

(c) una secuencia de ARNtracr

en la que (a) , (b) y (c) se colocan en una orientación de 5’ a 3’, en la que cuando se transcribe, la secuencia de emparejamiento de tracr se hibrida a la secuencia de ARNtracr y la secuencia guía dirige la unión específica de secuencias de un complejo de CRISPR a la secuencia diana, en la que el complejo de CRISPR comprende una proteína Cas9 de Tipo II que forma complejo con (1) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia diana, y (2) la secuencia de emparejamiento de tracr que se hibrida a la secuencia de ARNtracr, en la que la secuencia de ARNtracr tiene una longitud de 50 o más nucleótidos.

2. Un sistema vector de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas (CRISPR) (Cas) asociado a CRISPR (CRISPR-Cas) que comprende uno o más vectores que comprenden I. un primer elemento de regulación unido de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polinucleótidos de ARN quimérico (ARNchi) del sistema CRISPR-Cas tal como se define en la reivindicación 1, y

II. un segundo elemento de regulación unido de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II que comprende una o más secuencias de localización nuclear, de resistencia suficiente para conducir la acumulación de dicha proteína Cas9 en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota; en donde los componentes I y II se ubican en los mismos o diferentes vectores del sistema.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que la enzima Cas9 comprende una o más secuencias de localización nuclear de resistencia suficiente para conducir la acumulación de dicha enzima Cas9 en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota.

4. La composición de la reivindicación 1, o el sistema vector de la reivindicación 2, en los que la proteína Cas9 es una nucleasa que dirige la escisión de ambas hebras del sitio del polinucleótido.

5. La composición de la reivindicación 1, o el sistema vector de la reivindicación 2, en los que la proteína Cas9 comprende una o más mutaciones en un dominio catalítico, y es una nickasa que escinde solamente una hebra del sitio del polinucleótido.

6. El sistema vector de la reivindicación 2, o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas9 tiene codón optimizado para la expresión en una célula eucariota.

7. El sistema vector de la reivindicación 2, o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en el que los vectores son vectores virales.

8. El sistema vector de la reivindicación 7, en el que los vectores virales son vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adeno-asociados o herpes simplex.

9. El sistema vector de la reivindicación 2, o cualquier reivindicación dependiente de la misma, en las que el sistema vector comprende secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican dos o más señales de localización nuclear (NLS) expresadas con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas9.

10. El sistema vector de la reivindicación 9, en el que, cuando se expresa, al menos una NLS se encuentra en o cerca del extremo amino de la proteína Cas9 y/o al menos una NLS se encuentra en o cerca del extremo carboxi de la proteína Cas9.

11. El sistema vector de la reivindicación 9, en el que al menos una NLS se encuentra en o cerca del extremo amino de la proteína Cas9 y al menos una NLS se encuentra en o cerca del extremo carboxi de la proteína Cas9.

12. Uso de la composición de la reivindicación 1, o el sistema vector de la reivindicación 2 o cualquier reivindicación dependiente de las mismas para ingeniería genómica, con la condición de que dicho uso no sea un método para el tratamiento del organismo humano o animal mediante cirugía o terapia, y con la condición de que dicho uso no sea un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos.

13. El uso de la reivindicación 12 en el que la ingeniería genómica comprende la modificación de polinucleótido diana en una célula eucariota, la modificación de la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota, la generación de una célula eucariota modelo que comprende un gen de enfermedad mutado, o genosupresión de un gen.

14. El uso de la reivindicación 12 en donde el uso comprende adicionalmente la reparación de dicho polinucleótido diana escindido mediante la inserción de un polinucleótido molde exógeno, en donde dicha reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, la deleción o la sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido diana.

15. El uso de la reivindicación 12 en donde el uso comprende adicionalmente la edición de dicho polinucleótido diana escindido mediante la inserción de un polinucleótido molde exógeno, en donde dicha edición da como resultado una mutación que comprende la inserción, la deleción o la sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido diana.

16. El uso de las reivindicacines 13 o 14 en donde la inserción se realiza mediante recombinación homóloga.

17. Uso de la composición de la reivindicación 1, o el sistema de la reivindicación 2 o cualquier reivindicación dependiente de las mismas, en la producción de un animal transgénico no humano o planta transgénica.