Una combinación de al menos dos oligómeros para la amplificación de una región diana de VHA quecomprende:

oligómeros de 23 a 26 nt contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 138 que incluyen por lo menos la secuencia deSEQ ID NO: 139 o SEQ ID NO: 140, u oligómeros con un tamaño dentro de un intervalo de 19 a 25 nt contenidos enla secuencia de SEQ ID NO: 141, que contienen al menos una secuencia de SEQ ID NOs 142 a 146, u oligómeroscebadores promotores con un tamaño dentro de un intervalo de 50 a 53 nt, que incluyen porciones específicas deuna diana de VHA de una cualquiera entre SEQ ID NOs 21 a 27.

Composiciones y métodos para la detección de ácido nucleico del virus de la hepatitis A

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la detección diagnóstica de un virus humano y específicamente se refiere a ensayos para detectar secuencias del virus humano de la hepatitis A, empleando la amplificación de ácido nucleico in vitro y la detección de secuencias amplificadas.

Antecedentes de la invención

El virus de la hepatitis A (VHA) es el agente causante de una forma de hepatitis que puede producir síntomas que incluyen fiebre, fatiga, náuseas, dolor abdominal, diarrea, pérdida de apetito e ictericia, durante menos de dos meses. De las personas infectadas con el VHA, aproximadamente del 10% al 15% tienen síntomas prolongados o recurrentes durante un período de seis a nueve meses después de la infección. Una inmunidad frente al VHA, basada en la producción individual de inmunoglobulina G (IgG) anti-VHA, es la consecuencia de las infecciones sintomáticas y asintomáticas.

Aunque la incidencia de infecciones por VHA se ha reducido drásticamente en algunas partes del mundo en donde la vacunación contra el VHA (por ejemplo, mediante el uso de VHA inactivado) se ha utilizado generalmente desde finales de 1990, pueden aparecer infecciones epidémicas por VHA (más de 700 casos por 100.000 habitantes) en poblaciones no inmunes, en donde hay condiciones sanitarias deficientes, aunque sean temporalmente, por ejemplo, después de un terremoto. El VHA se excreta en las heces de las personas infectadas y generalmente se transmite por vía fecal-oral. Los brotes extendidos en una población pueden ser consecuencia de la transmisión por alimentos que se produce cuando un manipulador de alimentos infectado con el VHA, contamina los alimentos durante su preparación, o cuando los materiales alimentarios se contaminan durante el cultivo, la cosecha, el envasado o el tratamiento en el sistema de distribución. La transmisión también puede resultar del contacto con el suero, productos sanguíneos contaminados con VAH o agujas contaminadas, por ejemplo, por transfusión o por el uso de fármacos inyectados. Las personas con riesgo de infección con el VHA incluyen las que tienen familia o contacto sexual con una persona infectada con el VHA, personas que tienen trastornos de los factores de coagulación (por ejemplo, hemofilia) o una enfermedad hepática crónica, personas que viajan a países en donde es común la hepatitis A, hombres que tienen relaciones sexuales con hombres, consumidores de drogas ilegales y niños que viven en zonas con índices elevados de hepatitis A (por ejemplo, >20 casos por 100.000 habitantes) .

El VHA es un virus de ARN de 27-nm (picornavirus) que contiene un genoma de ARN monocatenario positivo de aproximadamente 7, 5 kb, para el que se ha encontrado un único serotipo en todo el mundo. El VHA se replica en el hígado, se excreta en la bilis, y se elimina en las heces (hasta 108 virus por ml) durante la fase aguda de una infección. El período de incubación suele ser de dos a seis semanas antes de que aparezcan los síntomas. El diagnóstico de la hepatitis A no puede diferenciarse de otros tipos de hepatitis víricas, por los síntomas u otras características clínicas (por ejemplo, niveles elevados de aminotransferasas en suero) . Típicamente, el diagnóstico de la hepatitis A se confirma mediante pruebas serológicas que proporcionan resultados positivos por la presencia de inmunoglobulinas (Ig) anti-VHA. La IgM anti-VHA generalmente se presenta cinco a diez días antes de la aparición de los síntomas y es indetectable en la mayoría de los pacientes hasta seis meses más tarde, mientras que la IgG anti-VHA aparece tempranamente durante la infección y sigue siendo detectable durante toda la vida del individuo. El ARN de VHA se puede detectar en la sangre y las heces de la mayoría de las personas durante la fase aguda de la infección, mediante el uso de métodos para someter a ensayo ácidos nucleicos, por ejemplo, la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , y la secuenciación de ácidos nucleicos, que se ha utilizado para identificar la relación genética del VHA con posterioridad a infecciones extendidas en una población (Dato y col., Morbidity Mortality Wkly. Rpt., 2003, 52 (47) : 1155-57; LaPorte y col., Morbidity Mortality Wkly. Rpt., 2003, 52 (24) :565-67) . Estos métodos, sin embargo, no se utilizan generalmente para fines de diagnóstico.

El documento de patente WO 03/106641 A (Chiron Corp., ) describe combinaciones de cebadores localizados en la 5‘-UTR del genoma de VHA. El documento de patente WO 91/11534 A (US Health, 8-8-1991) describe cebadores localizados en 32-60 y 240-266 (pág. 9) y una sonda localizada en 161-187 (pág. 11) . Fujiwara

K. y col. (Digestive Diseases and Sciences, vol. 45, nº 12, páginas 2422-2427) describen cebadores que amplifican un fragmento localizado en 277-551. Costa-Mattioli M. y col. (Journal of Viral Hepatitis, vol. 9, nº 2, páginas 101-106) describen cebadores localizados en la posición 22 (directo) y 85-107 (inverso) y una sonda localizada en la posición

58.

En los EE.UU., cada año mueren aproximadamente 100 personas a causa de insuficiencia hepática aguda debida a la hepatitis A (tasa de mortalidad de aproximadamente 0, 015%) . Incluso en los casos no mortales de hepatitis A, hay unos costes sustanciales asociados con las infecciones por VHA, incluidos los costes de hospitalización del paciente, las visitas ambulatorias y los días de trabajo perdidos. Los costes en salud pública asociados con brotes de hepatitis A, incluyen la localización y administración de inmunoglobulina a las personas expuestas a un individuo infectado o a una fuente infecciosa (por ejemplo, agua o alimentos contaminados) hasta dos semanas después de la exposición. El riesgo potencial de infección, sobre todo para brotes extendidos en una población puede provocar unos costes sicológicos importantes y pérdidas económicas. Debido a la relativa facilidad para transmitir el VHA en el agua y en alimentos contaminados, y la morbilidad asociada con la hepatitis A, el VHA es un agente potencial para uso en terrorismo biológico.

Existe una necesidad de detectar con precisión la presencia de VHA en muestras biológicas y ambientales. Existe una necesidad de diagnosticar rápidamente a los individuos infectados con VHA. Por ejemplo, ya que la inmunoglobulina para ser eficaz se debe administrar a una persona hasta dos semanas después de la exposición al VHA, existe una necesidad de un ensayo rápido y preciso para evaluar prontamente los manipuladores de alimentos con síntomas de hepatitis e informar a las agencias de salud pública de fuentes positivas para VHA. Existe una necesidad de detectar VHA presente en materiales contaminados, tales como el agua y los alimentos, para evitar brotes extendidos en poblaciones o epidemias, como resultado del uso o del consumo de estos materiales. También existe una necesidad de detectar la contaminación con VHA, en productos que se pueden utilizar en un tratamiento médico, por ejemplo, sangre o suero utilizado para transfusiones o para la preparación de factores obtenidos a partir de fluidos humanos

La presente invención responde a estas necesidades, divulgando secuencias de oligonucleótidos utilizadas en métodos para someter a ensayo el ácido nucleico para detectar la presencia de ácido nucleico de VHA en una muestra.

Sumario

La invención incluye oligómeros de ácido nucleico, útiles para la purificación, amplificación y detección de secuencias diana de VHA. Tales oligómeros o combinaciones de oligómeros pueden estar contenidos en una configuración de kit, cuyas realizaciones pueden incluir oligómeros adicionales y/u otros reactivos para la amplificación y/o detección de una secuencia de VHA. La invención también incluye métodos para la detección de VHA en una muestra, que emplean las etapas de purificar el ácido nucleico de VHA a partir de otros componentes en la muestra, amplificar una secuencia diana de ARN de VHA o ADNc obtenido a partir del mismo, mediante el uso de una polimerasa de ácido nucleico in vitro y cualquier combinación de oligómeros para la amplificación, tal y como se describe en la presente memoria, para producir un producto amplificado, y la detección del producto amplificado empleando una sonda de detección que se hibrida específicamente con al menos una porción del producto amplificado. En una realización, el ácido nucleico de VHA se purifica empleando al menos un oligómero de captura que incluye una secuencia que se... [Seguir leyendo]

1. Una combinación de al menos dos oligómeros para la amplificación de una región diana de VHA que comprende:

oligómeros de 23 a 26 nt contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 138 que incluyen por lo menos la secuencia de SEQ ID NO: 139 o SEQ ID NO: 140, u oligómeros con un tamaño dentro de un intervalo de 19 a 25 nt contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 141, que contienen al menos una secuencia de SEQ ID NOs 142 a 146, u oligómeros cebadores promotores con un tamaño dentro de un intervalo de 50 a 53 nt, que incluyen porciones específicas de una diana de VHA de una cualquiera entre SEQ ID NOs 21 a 27.

2. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionados entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144 y SEQ ID NO: 145.

3. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente al menos un oligómero de una sonda de captura seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 1 a 7 o una secuencia específica de una diana fijada covalentemente a una secuencia o a un resto que se une a una sonda inmovilizada, seleccionándose dicha secuencia específica de una diana entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs 8 a 14.

4. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho al menos un oligómero de captura se selecciona entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 2, 3 y 4 o una secuencia específica de una diana ligada covalentemente a una secuencia o a un resto que se une a una sonda inmovilizada, seleccionándose dicha secuencia específica de una diana entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 9, 10 y 11.

5. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente al menos un oligómero de una sonda de detección seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NO 109 y SEQ ID NO: 111.

6. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dichos al menos dos oligómeros comprenden un primer oligómero de amplificación seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 21 a 27 y un segundo oligómero de amplificación seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 15 a 18 y80 a 85.

7. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 6, en donde uno de dichos al menos dos oligómeros es SEQ ID NO: 16 y el otro de dichos al menos dos oligómeros es SEQ ID NO: 22.

8. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha composición comprende adicionalmente al menos un oligómero de captura seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 2, 3 y 4.

9. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha combinación comprende adicionalmente al menos una sonda de detección seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 109 y 111.

10. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha combinación comprende adicionalmente al menos un oligómero de captura seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 2 a 4.

11. La combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha combinación comprende adicionalmente al menos una sonda de detección seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 109 y 111.

12. Un kit que comprende una combinación de al menos dos oligómeros de acuerdo con la reivindicación 1.

13. Un método para detectar la presencia de VHA en una muestra que comprende las etapas de:

purificar un ácido nucleico de VHA a partir de otros componentes en una muestra que contiene VHA;

amplificar una secuencia diana de VHA en el ácido nucleico purificado de VHA, o un ADNc obtenido a partir del mismo, empleando una reacción de amplificación in vitro que incluye al menos dos oligómeros de la amplificación, específicos de una región diana de VHA seleccionada, que incluyen:

oligómeros de 23 a 26 nt contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 138 que incluyen por lo menos la secuencia de SEQ ID NO: 139 o SEQ ID NO: 140, u oligómeros con un tamaño dentro de un intervalo de 19 a 25 nt contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 141, que contienen al menos una secuencia de SEQ ID NOs 142 a 146, u oligómeros cebadores promotores con un tamaño dentro de un intervalo de 50 a 53 nt, que incluyen porciones específicas de una diana de VHA de una cualquiera entre SEQ ID NOs 21 a 27;

para producir un producto amplificado de una región diana de VHA seleccionada; y

detectar el producto amplificado empleando una sonda de detección que se hibrida específicamente con al menos una porción del producto amplificado.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la etapa de purificación pone en contacto la muestra con al menos un oligómero de una sonda de captura que comprende una secuencia contenida en una cualquiera entre SEQ ID NOs 1 a 7 o una secuencia específica de una diana fijada covalentemente a una secuencia

o a un resto que se une a una sonda inmovilizada, seleccionándose dicha secuencia específica de una diana entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs 8 a 14, en donde dicho oligómero de una sonda de captura se hibrida específicamente con una secuencia en el ARN de VHA para formar un complejo de hibridación con el ARN de VHA, y se separa el complejo de hibridación que contiene el ARN de VHA de otros componentes de la muestra.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la etapa de amplificación amplifica una secuencia empleando al menos dos oligómeros específicos de la primera región diana de VHA seleccionados entre el grupo consistente en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144 y SEQ ID NO: 145; y en donde la etapa de detección emplea al menos una sonda de detección que se hibrida específicamente con el producto amplificado.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde en dicha etapa de detección dicho oligómero de detección se selecciona entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 109 y 111.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dichos al menos dos oligómeros de amplificación comprenden un primer oligómero de amplificación seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 21 a 27 y un segundo oligómero de amplificación seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 15 a 18 y 80 a 85.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde uno de dichos al menos dos oligómeros de amplificación es SEQ ID NO: 16 y otro de dichos al menos dos oligómeros es SEQ ID NO: 22.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde en dicha etapa de purificación se pone en contacto la muestra con al menos un oligómero de captura seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 2, 3 y 4.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicha etapa de purificación comprende la etapa de capturar un ácido nucleico de VHA introduciendo al menos un oligómero de captura dentro de dicha muestra.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho al menos un oligómeros de captura se selecciona entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 2, 3 y 4 o una secuencia específica de una diana unida covalentemente a una secuencia o a un resto que se une a una sonda inmovilizada, en donde dicha secuencia específica de una diana se selecciona entre el grupo consiste en SEQ ID NOs 9 y 10 y 11.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde dicha sonda de detección se selecciona entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 109 y 111.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicha etapa de purificación pone en contacto la muestra con al menos un oligómero de captura seleccionado entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 2, 3 y 4.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicha sonda de detección se selecciona entre el grupo consistente en SEQ ID NOs 109 y 111.