Sistema de expresión.

Un sistema de expresión de proteína, que comprende:

a) un promotor T7A3 ligado operablemente a

b) una secuencia operadora palindrómica perfecta.

Sistema de expresión La presente invención se refiere a un sistema de expresión adecuado para la expresión microbiana de polipéptidos recombinantes.

Desde la patente US 6.537.779 se conocen sistemas de expresión de proteínas basados en secuencias operadoras palindrómicas perfectas basadas en T7. Los sistemas basados en T7 presentan inconvenientes porque el funcionamiento del sistema de T7 requiere polimerasa de fago que se proporciona comúnmente insertando un profago !DE3 que expresa la polimerasa de fago requerida en la cepa huésped de Escherichia coli para crear cepas huésped lisogénicas. La polimerasa de fago también puede suministrarse a la célula mediante infección con un fago de transducción ! especializado que porta el gen para la polimerasa de fago (por ejemplo ARN polimerasa de T7) . El profago !DE3 carece de los elementos genéticos requeridos para el corte del profago para formar partículas de fago líticas. Sin embargo, se ha mostrado que cepas huésped lisogénicas de !DE3 liberan partículas de fago y por tanto provocan infecciones no deseadas en plantas de fermentación. De hecho, no se permite el uso de cepas de !DE3 a determinados operadores de plantas de fermentación.

La expresión de la proteína heteróloga antes de la inducción no es deseable porque algunas proteínas heterólogas tienen efectos perjudiciales sobre el crecimiento de la célula huésped y la estabilidad del plásmido, lo que reduce la productividad global. Para evitar esto, los sistemas de expresión basados en T7 controlan generalmente la expresión de proteínas heterólogas en dos niveles. En primer lugar, se requiere la inducción de la expresión del gen de ARN polimerasa de T7 para producir ARN polimerasa de T7 para conducir la expresión a partir del promotor de T7. En segundo lugar, también se necesita inducir el propio promotor de T7. Esto aumenta la complejidad del funcionamiento de los sistemas de expresión basados en T7.

Lanzer et al, Proc. Nat. Acad. Sci. Vol. 85, p. 8973-7 (1988) describe la influencia de la localización del operador lac sobre la represión de diversos promotores. Becker et al, J. Molecular Biology, Vol. 349, nº 4, p. 716-30 (2005) describe que la naturaleza, localización y de operadores desempeñan un papel en la formación de bucles de represión. Edamatsu et al, Gene, Vol. 187, nº 2, p. 289-94 (1997) describe una expresión de mamífero que comprende tres operadores lac en dirección 3’ del promotor EF-1x humano. Brosius et al, Proc. Nat. Acad. Sci. vol. 81, Vol. 81, p. 6929-33 (1984) describe la regulación de promotores de ARN ribosómico con un operador lac sintético. Savochina et al, Molecular & General Genetics, Vol. 189, nº 1 p. 142-7 (1983) describe aspectos de estabilidad plasmídica de la clonación de los promotores del fago T7 T7A1, T7A2 y T7A3 en tándem en plásmidos. Chidgeavadze et al, Nucleic Acids Research, Vol. 12, nº 3, p. 1671-86 (1984) describe que 2, 3’-didesoxi-3’aminonucleósido-5’-trifosfatos son terminadores de la síntesis de ADN catalizada por ADN polimerasas.

Existe un gran número de sistemas de expresión de proteínas heterólogos con diferentes modos de control e inducción, haciendo que la selección y optimización del sistema de expresión/procedimiento de fermentación para proteínas de interés sea un procedimiento enormemente empírico. Esto requiere mucho tiempo y no es deseable. Por tanto, hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar un control mejorado de la expresión y niveles mejorados de expresión de proteínas sin el uso de polimerasa de fago ni cepas huésped lisogénicas. También hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar una expresión heteróloga inducible en células procariotas, así como en células eucariotas tales como células de mamíferos y levaduras.

Según la presente invención, se proporciona un sistema de expresión de proteínas que comprende:

a) un promotor T7A3; y

b) una secuencia operadora palindrómica perfecta.

Las secuencias operadoras que pueden emplearse en el sistema de expresión según la presente invención incluyen lac, gal, deo y gln. Se pueden emplear una o más secuencias operadoras palindrómicas perfectas. En muchas realizaciones preferidas, se emplean dos secuencias operadoras palindrómicas perfectas, más ventajosamente una secuencia operadora que está situada en dirección 3’ del promotor, y estando situada una secuencia operadora en dirección 5’ del promotor. Cuando se emplean dos sistemas de operador, las secuencias operadoras están preferiblemente separadas para maximizar el control del promotor. En muchas realizaciones, la separación es de de 85 a 150 pares de bases, preferiblemente de 90 a 126 pares de bases, y lo más preferiblemente de 91 ó 92 pares de bases. En determinadas realizaciones, una secuencia operadora se solapa con el punto de inicio transcripcional.

Se reconocerá que el sistema operador se emplea comúnmente con una secuencia represora apropiada. Las secuencias represoras producen proteína represora, por ejemplo la secuencia génica lacl cuando se usan operadores lac. También pueden usarse otras secuencias represoras de lac, por ejemplo puede usarse la secuencia laclQ para aumentar el nivel de la proteína represora lac. La secuencia represora también puede proporcionarse mediante el genoma de célula huésped o mediante el uso de un plásmido compatible adicional.

El sistema de expresión puede estar integrado en el genoma de la célula huésped, pero está comprendido preferiblemente dentro de un elemento extracromosómico tal como un plásmido. Alternativamente, el sistema de expresión puede estar incorporado en vectores fágicos o virales, y éstos pueden usarse para suministrar el sistema de expresión en el sistema de célula huésped. Pueden ensamblarse plásmidos o vectores de expresión mediante métodos conocidos en la técnica. El plásmido también comprende normalmente uno o más de los siguientes: un marcador seleccionable, por ejemplo una secuencia que confiere resistencia a antibióticos, una secuencia de estabilidad cer y un casete de expresión. El sistema de expresión también puede incorporar una secuencia señal si se requiere secreción de la proteína deseada.

La expresión puede inducirse mediante la adición de un inductor tal como isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) , análogos de IPTG tales como isobutil-C-galactósido (IBCG) , lactosa o melibiosa. Pueden usarse otros inductores, y se describen más completamente en otra parte (por ejemplo, véase The Operon, eds Miller and Renznikoff (1978) ) . Pueden usarse inductores individualmente o en combinación. La construcción de plásmidos o vectores de expresión apropiados resultará evidente para el científico de pericia normal.

El sistema de expresión de la presente invención se puede emplear para expresar proteínas en células huésped, y especialmente en microorganismos. Tal como se usa en el presente documento, “proteínas” se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente 10 aminoácidos. La célula huésped puede ser procariota o eucariota. Los ejemplos de células procariotas incluyen células bacterianas, por ejemplo células bacterianas gram-negativas, incluyendo E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marsescens y Pseudomonas aeruginosa, y células bacterianas gram-positivas incluyendo Bacillus subtilis. Los ejemplos de células eucariotas incluyen levaduras, tales como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe. Las células huésped de mamífero que se pueden emplear incluyen estirpes celulares humanas, tales como células de riñón embriónico humano y PERC.6; estirpes celulares murinas, tales como células NS0; y particularmente estirpes celulares de hámster, tales como células de riñón de hámster neonato y especialmente células de ovario de hámster chino. También se pueden emplear otras células huésped eucariotas, tales como aquellas de hongos filamentosos, células vegetales, de insectos, de anfibios, o especies ovíparas. Las células huésped preferidas son bacterias, particularmente enterobacteriáceas, preferiblemente E. coli, y especialmente sus cepas B o K12.

El sistema de expresión de la presente invención se emplea comúnmente en forma de un plásmido, y los plásmidos que comprenden un promotor T7A3 y una secuencia operadora palindrómica perfecta forman otro aspecto de la presente invención. Los plásmidos pueden ser plásmidos de replicación autónoma o plásmidos de integración.

El sistema de expresión de la presente invención se emplea ventajosamente para la fabricación de proteínas, especialmente proteínas recombinantes,... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de expresión de proteína, que comprende: a) un promotor T7A3 ligado operablemente a b) una secuencia operadora palindrómica perfecta.

2. Un vector que comprende: a) un promotor T7A3 ligado operablemente a b) una secuencia operadora palindrómica perfecta.

3. Un vector según la reivindicación 2, que comprende además un casete de expresión para una proteína.

4. Un vector según las reivindicaciones 2 ó 3, en el que el vector es un plásmido, preferiblemente un plásmido que se replica de forma autónoma.

5. Una célula huésped transformada mediante un vector como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Un método para la producción de una proteína recombinante, que comprende expresar un sistema de expresión que comprende: a) un promotor T7A3; operablemente ligado a

b) una secuencia operadora palindrómica perfecta; y operablemente enlazada a c) un casete de expresión para una proteína recombinante.

7. Un sistema de expresión, vector, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sistema operador es lac, gal, deo o gln.

8. Un sistema de expresión, vector, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se emplea una secuencia operadora palindrómica perfecta individual, que está situada preferiblemente en dirección 3’ del promotor.

9. Un sistema de expresión, vector, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el operador tiene la secuencia GGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC (nucleobases 51 a 74 de SEC ID No. 3) .

10. Un sistema de expresión, vector, células huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que un operador solapa el punto de partida transcripcional.

11. Un método para producir una proteína, que comprende: a) cultivar una célula huésped transformada con un vector según la reivindicación 3; y b) recuperar la proteína.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que la célula huésped es E. coli.

13. Un método según las reivindicaciones 11 ó 12, en el que el vector es un vector como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.

14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que un operador solapa el punto de partida transcripcional.

Figura 1 Secuencia de la fusión GST-3C (SEC ID nº 23)

Figure 2 Secuencia de interferón #2 (SEC ID nº 24)

Figura 3 Secuencia de eritropoyetina (EPO) (SEC ID nº 25)

Figura 4 Secuencia de L-2-haloalcanoato deshalogenasa (hadL) (SEC ID nº 26)

Figura 5

La flecha indica la posición para la proteína HadL Línea 1: Marcadores de peso molecular Línea 2: Matraz 1 – pre-inducción de CLD075 Línea 3: Matra.

2. pre-inducción de CLD075 Línea 4: Matraz 1 - CLD075, 6 h de cultivo, 3 h tras inducción con 0, 5 mM IPTG Línea 5: Matra.

2. CLD075, 6 h de cultivo, sin inducción Línea 6: Matraz 1 - CLD075, 23 h de cultivo, 20 h tras inducción con 0, 5 mM IPTG Línea 7: Matra.

2. CLD075, 23 h de cultivo, sin inducción Línea 8: Marcadores de peso molecular