Pestivirus mutante con mutaciones en el gen de núcleo y la región NS3.
Pestivirus mutante, caracterizado porque el virus tiene una mutacion en el gen que codifica la proteina denucleo,
haciendo que el virus no pueda expresar una proteina de nucleo funcional, caracterizandose el virus5 adicionalmente porque contiene una o mas mutaciones en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3que compensan la falta de una proteina de nucleo funcional
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/061989.
Solicitante: INTERVET INTERNATIONAL B.V.
Nacionalidad solicitante: Países Bajos.
Dirección: WIM DE KÖRVERSTRAAT 31 5831 AN BOXMEER PAISES BAJOS.
Inventor/es: THIEL, HEINZ-JURGEN, RUEMENAPF,Hans Tillmann, HEIMANN,Manuela.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K39/12 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Antígenos virales.
- C07K14/08 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Virus ARN.
- C12N7/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).
PDF original: ES-2387637_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Pestivirus mutante con mutaciones en el gen de núcleo y la región NS3
La presente invención se refiere a pestivirus mutantes y a vacunas que contienen dichos virus. Los pestivirus causan enfermedades económicamente importantes en los animales en todo el mundo. El género pestivirus, dentro de la familia Flaviviridae, comprende al menos tres especies: virus de la diarrea vírica bovina (VDVB) , virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) y virus de la enfermedad de Borna (VEB) ovina. Se ha descrito la presencia de un cuarto grupo separado de pestivirus que comprende cepas aisladas de ganado vacuno y ovejas, y ahora se acepta generalmente para referirse a esta especie adicional como VDVB-2; por consiguiente, las cepas de VDVB clásico se llaman VDVB-1.
El VFPC produce fiebre porcina clásica en cerdos. La fiebre porcina clásica es una enfermedad de los cerdos altamente contagiosa y algunas veces mortal y puede producir considerables pérdidas económicas.
Los animales pueden protegerse contra el VFPC por vacunación; sin embargo, las vacunas vivas inactivadas o modificadas convencionales tienen desventajas en lo referente a la seguridad, además de la eficacia. Por tanto, deben desarrollarse tipos mejorados de vacunas.
El virus de la diarrea vírica bovina (VDVB) es una causa de enfermedad congénita y entérica con un amplio intervalo de manifestaciones clínicas. La enfermedad se describió por primera vez como una enfermedad transmisible de ganado vacuno con una alta morbilidad y baja mortalidad. El ganado vacuno afectado mostró temperatura elevada, diarrea y tos. La afección se llamó diarrea vírica bovina. Hoy en día, el VDVB se considera que es un patógeno importante de ganado vacuno con un impacto económico mundial. El patrón clínico de infección por el VDVB dentro de un rebaño y, por consiguiente, su impacto sobre la producción, dependen de la interacción de varios factores, que incluyen la cepa del virus, edad del ganado vacuno, inmunidad en el rebaño e interacción de factores estresantes. VDVB-1 y VDVB-2 producen ambos infecciones agudas en ganado vacuno (diarrea, fiebre, síndrome hemorrágico) , además de (si la infección se produce durante el embarazo) aborto, malformación del feto e infección persistente de los terneros.
El genoma de los pestivirus consiste en una única cadena de (+) ARN y contiene un único marco de lectura abierto (ORF) grande, flanqueado por una 5' UTR y una 3' UTR. El ORF codifica una poliproteína precursora grande que da lugar a 11 a 12 productos de escisión. El ORF se procesa en las diversas proteínas víricas por proteasas celulares, además de víricas. Las proteínas víricas en el ORF están dispuestas en el orden: NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. Los viriones de pestivirus consisten en cuatro proteínas estructurales, la proteína de núcleo pequeña positivamente cargada (C) , que se supone que junto con el genoma del ARN forma una estructura de nucleocápside, y tres proteínas de la envuelta glicosiladas (Erns, E1, E2) . La actividad neutralizante se demostró predominantemente para anticuerpos específicos para E2.
Los requisitos mínimos para la replicación de pestivirus se investigaron, por ejemplo, creando genomas de pestivirus defectuosos que carecían de secuencias génicas para las proteínas estructurales. Se encontró que los genomas de VFPC defectuosos todavía se replicaban y podían encapsidarse en partículas víricas cuando se introdujeron en células SK-6 junto con ARN de A187-CAT auxiliar (Moser y col., J. Virol., 7787-7794, 1999) . Se había descrito un genoma de VDVB autónomamente replicante, pero defectuoso, que carecía de los genes que codifican C, Erns, E1, E2, p7 y NS2 (Behrens y col., J. Virol., 72, 2364-2372, 1998) . Los mutantes de deleción C y E1 complementados en trans de otro pestivirus, VDVB, se describieron por Beer y col. en el documento WO04/016794.
Para VFPC se ha demostrado que los mutantes muestran atenuación vírica. Por ejemplo, Risatti y col., Virology 364, 371-382, 2007, describe mutantes de VFPC con sustituciones en la región E2 que mostraron un fenotipo atenuado. Maurer y col., Vaccine, 23 (25) , 3318-28, 2005 también describen mutantes de E2 del VFPC que carecen de todo o parte del gen E2 que mostró protección parcial contra la exposición letal a VFPC altamente virulento. Meyers y col., Journal of Virology, 73 (12) , 10224-10235, 1999, describen mutantes de VFPC con mutaciones en el gen que codifica la proteína Erns que conducen a mutaciones. Los mutantes de deleción Erns complementados en trans de VFPC se describieron por Wildjojoatmodjo y col., J. Virol., 74 (7) , 2973-80, 2000.
La presente invención proporciona mutantes de pestivirus que tienen una deleción en el gen que codifica la proteína de núcleo, haciendo que el virus no pueda expresar una proteína de núcleo funcional, en los que el virus se caracteriza adicionalmente porque contiene una o más mutaciones en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 que compensan la falta de una proteína de núcleo funcional.
Preferentemente, el pestivirus mutante según la presente invención es un virus de la fiebre porcina clásica (VFPC) o un virus de la diarrea vírica bovina (VDVB) .
La mutación en la región del gen que codifica la proteína de núcleo es tal que no puede expresar proteína de núcleo funcional. Esto puede lograrse delecionando el gen que codifica la proteína de núcleo por completo o en parte.
La secuencia señal en el extremo C de la proteína de núcleo es esencial para otro procesamiento de la poliproteína en la dirección 3'. Por tanto, en la deleción (de parte) del gen de núcleo debe tenerse cuidado de que se retengan las secuencias señal de translocalización para Erns.
La secuencia de translocalización es un estiramiento de 18 aminoácidos localizado entre los aminoácidos 250 y 267, precediendo el sitio de escisión antes del extremo N de la proteína Erns de VFPC (Ala-267/Glu-268) . (Rümenapf y col., J. Virol., 65 (2) , 589-597, 1991; Rümenapf y col., J. Virol., 67 (6) , 3288-3294, 1993) . Para VDVB, el sitio de escisión antes del extremo N de la proteína Erns es Gly-270/Glu-271.
La longitud exacta de las secuencias necesarias para el procesamiento en la dirección 3' puede variar por cepa o tipo de célula. Por ejemplo, para VFPC, la secuencia codificante de núcleo puede delecionarse del aminoácido 169248 (p619) , fusionándose así el extremo C de Npro hasta los aminoácidos del extremo C de la proteína de núcleo que constituyen la señal de translocalización para Erns (CPLWVTSC168/LEKALLAWAVITILLYQPVAA267/ENIT) . Para VDVB, la secuencia codificante de núcleo puede delecionarse a partir del aminoácido 169-251, fusionándose así el extremo C de Npro hasta los aminoácidos del extremo C de la proteína de núcleo que constituyen la señal de translocalización para Erns de VDVB (CPLWVSSC168/LEKALLAWAIIALVFFQVTMG270/ENIT) . La deleción de gran parte del gen de núcleo permitió la replicación del ARN después de la transfección, pero no se produjo progenie de virus infecciosos.
Con la presente invención se ha encontrado que la ausencia de un gen que codifica una proteína de núcleo funcional puede compensarse por mutaciones en la región NS3 del genoma vírico.
La introducción de estas mutaciones en una copia de ADNc de pestivirus en la que se delecionó el gen de núcleo (como se ha descrito anteriormente) permitió la recuperación de virus infecciosos.
Las mutaciones en la región NS3 se agrupan en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3, más específicamente dentro de los 100 aminoácidos del dominio del extremo C.
Para VFPC se identificaron siete mutaciones independientes en el dominio del extremo C del dominio helicasa de la región de la región NS3 (aminoácidos 2160 -2260) .
Los virus de FPC mutantes preferidos según la invención tienen una o más mutaciones en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3, seleccionados del grupo que consiste en Asn2177Tyr, Glu2160 Gly, Pro2185Thr/Ala, Gln2189Lys, Pro2200Thr y Asn2256Asp.
La introducción de la mutación Asn2177Tyr en el núcleo de VFPC Δ (p619) y la electroporación del ARNc condujo a la sorprendente liberación de partículas de virus infecciosos viables. El ARN genómico apareció ligeramente reducido en tamaño en análisis de transferencia Northern y partículas de virus concentradas no contuvieron proteína de núcleo. Los... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Pestivirus mutante, caracterizado porque el virus tiene una mutación en el gen que codifica la proteína de núcleo, haciendo que el virus no pueda expresar una proteína de núcleo funcional, caracterizándose el virus
adicionalmente porque contiene una o más mutaciones en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 que compensan la falta de una proteína de núcleo funcional.
2. Pestivirus mutante según la reivindicación 1, caracterizado por que el pestivirus es virus de la fiebre
porcina clásica (VFPC) . 10
3. VFPC mutante según la reivindicación 2, caracterizado por que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 se selecciona del grupo que consiste en Asn2177Tyr, Glu2160 Gly, Pro2185Thr/Ala, Gln2189Lys, Pro2200Thr y Asn2256Asp.
4. VFPC mutante según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado por que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 comprende la mutación Asn2177Tyr.
5. Pestivirus mutante según la reivindicación 1, caracterizado por que el pestivirus es virus de la diarrea
vírica bovina (VDVB) . 20
6. VDVB mutante según la reivindicación 5, caracterizado por que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 se selecciona del grupo que consiste en Glu2189Lys, Leu2190Pro, Thr2191Ala, Asp2192 Glu, Pro2194Leu, Tyr2204His, Asn2265Tyr, Asn2265Asp.
7. VDVB mutante según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado por que la mutación en el dominio del extremo C del dominio helicasa de NS3 comprende la mutación Asp2192 Glu, Tyr2204His, Asn2265Tyr, o Asn2265Asp.
8. Una vacuna caracterizada por que comprende un pestivirus mutante según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 30
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