Parvovirus de roedor modificado capaz de propagarse y difundirse en gliomas humanos.

Una variante de parvovirus de roedor capaz de propagarse y difundirse a través de células tumoraleshumanas,

caracterizada porque la variante de parvovirus comprende (a) una deleción de 28 aminoácidos desde laposición 619 a 646 en el extremo C-terminal de NS1/desde la posición 126 a 153 en el exón medio de NS2 y (b) lasustitución de aminoácidos H374Y en VP1/2.

Parvovirus de roedor modificado capaz de propagarse y difundirse en gliomas humanos La presente invención se refiere a una variante de parvovirus de roedor capaz de propagarse y difundirse a través de células tumorales humanas, que se puede obtener realizando pases en serie de un parvovirus de roedor como cepa de partida en células tumorales humanas semipermisivas. También se refiere a una variante de parvovirus capaz de propagarse y difundirse a través de células tumorales humanas que se caracteriza por deleciones y/o sustituciones de aminoácidos particulares, por ejemplo, una deleción de varios aminoácidos en el extremo C-terminal de NS1/exón medio de NS2. La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que contiene tal parvovirus, así como a su uso para el tratamiento del cáncer, preferiblemente de un glioblastoma.

Los virus oncolíticos tales como los parvovirus de roedores representan nuevas herramientas para el tratamiento del cáncer. Además de destruir específicamente las células cancerosas (oncolisis) , estos agentes también proporcionan señales de peligro que provocan que el sistema inmune elimine tumores infectados por el virus. Como consecuencia de episodios oncolíticos, los sistemas inmunes innato y adaptativo acceden a los antígenos tumorales, lo que produce como resultado unos efectos de cebado cruzado y vacunación. Los parvovirus de roedores son virus de ADN de cadena sencilla que poseen una actividad oncolítica intrínseca, es decir, que preferentemente se replican en células cancerosas y destruyen las células tanto de origen murino como humano.

El glioblastoma es una enfermedad destructiva, que tiene unas posibilidades limitadas de tratamiento. Evidentemente, el pronóstico de pacientes requiere nuevos tratamientos. Los virus oncolíticos competentes en cuanto a la replicación mencionados anteriormente se consideran prometedores ya que son capaces de difundirse a través de tejidos malignos e inducir respuestas inmunes antitumorales. Entre ellos, los parvovirus de roedor parecen ser excelentes candidatos, debido a su oncotropismo natural, su capacidad para infectar células humanas, la toxicidad específica en células neoplásicas y la baja patogenicidad en seres humanos. En un modelo de rata, H1-PV fue capaz de causar una regresión completa de gliomas establecidos sin ninguna recidiva y se demostró que era capaz de dirigirse a diversos gliomas humanos, destruyendo de este modo de manera eficaz estas células, con independencia de su resistencia adquirida frente a inductores conocidos de la muerte celular. Aunque, H1-PV demostró ser capaz de infectar y de destruir eficazmente la mayor parte de las líneas celulares de glioblastoma humano sometidas a ensayo hasta la fecha, la mayoría de estas células se resistía a la replicación eficaz del virus, a la producción de partículas de la progenie y a la difusión. Este fracaso en la propagación y la difusión a través del tejido tumoral humano podría tener un efecto importante sobre la eficacia del tratamiento de gliomas humanos in vivo, no solo debido a que se limita la muerte celular a un único acontecimiento con éxito que solo alcanza a una proporción limitada de células tumorales, sino también debido a la falta de un transporte intracelular activo de los viriones de la progenie a la superficie celular.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención es superar este retroceso de las cepas de la técnica anterior, es decir, proporcionar parvovirus que son capaces de propagarse y difundirse a través del tejido tumoral humano.

De acuerdo con la invención, esto se consigue con los objetos definidos en las reivindicaciones. Experimentos iniciales de los inventores han mostrado que los viriones de la progenie de PV son transportados desde el núcleo hasta la periferia de la célula a través de vesículas, antes de la lisis celular que es cuando se liberan en el material sobrenadante del medio. Por otra parte, esta salida vesicular está asociada con múltiples proteínas intracelulares (incluyendo posibles antígenos tumorales) que se transportan como una "carga asociada" a la superficie de la célula y podría contribuir a la estimulación inmune antitumoral del hospedador. Para subsanar los defectos de la cepa aislada original H1-PV (pSR19) en la propagación y la difusión vírica en glioblastoma humano, los inventores pretendían obtener variantes de H1-PV competentes en cuanto a la propagación, realizando pases en serie en líneas celulares humanas de glioblastoma obtenidas a partir de pacientes semipermisivos, es decir, para eludir los posibles impedimentos durante el proceso de infección (falta de envoltura, entrega del genoma vírico al núcleo, conversión a doble cadena) . El ADN del clon infeccioso de H1-PV (pSR-19) se transfectó a diferentes líneas celulares humanas de glioblastoma (por ejemplo, NCH149, NCH82, NCH89) y este ADN competente en cuanto a la replicación se sometió a pases hasta que se hicieron visibles los efectos citopáticos. Se realizaron pases víricos adicionales (>15) combinando viriones de la progenie asociados con células, obtenidos a través de ciclos repetidos de congelación y descongelación en vTE pH 8, 7 con virus liberados al medio mediante infección. Una mezcla de virus competentes en cuanto a la propagación se analizó a continuación, después de 25 pases en células NCH149 que presentaban amplificación eficaz del ADN vírico, generación de viriones de la progenie y difusión a través de una variedad de cultivos de glioblastoma humano. A partir de esta mezcla original, se aislaron clones de virus individuales mediante purificación en placa sobre células NB 324K, se amplificaron nuevamente sobre células NCH149, se clonaron y se secuenciaron.

El análisis genético de todas las variantes de H1-PV ha puesto de manifiesto una deleción de 84 nts que afecta a 28 aminoácidos de la región codificadora de NS1 (C-terminal) y NS2 y una única transición de citosina a timidina en la posición 3913 que cambia His374 a Tyr en VP2. Dos sustituciones adicionales de guanidina a adenosina en la región VP2 (3964 y 4108) que conducen a un cambio de Asp391 a Asn y de Asp439 a Ser, solo se han atribuido a dos cepas aisladas. Algunos cambios en las regiones 3’ no codificantes permanecieron con prevalencia diversa. Al parecer, la región situada aproximadamente entre los nts 2000 a 2200 comprende un punto clave de la variabilidad que permite que H1-PV, a través de la modulación de la función de NS1/NS2, se adapte al entorno del hospedador. Por

lo tanto, es posible modificar activamente la gama de hospedadores de H1-PV, y también las otras cepas de PV de rata estrechamente relacionadas, H3 y TVX, a través de inserciones/deleciones dentro de esta región.

Las variantes de H1-PV recién generadas son capaces de propagarse y difundirse a través de células (líneas celulares) de glioblastoma humano. Esto permite un aumento de la infección/destrucción de tumores humanos ya establecidos y, en consecuencia, se espera que se produzca una estimulación inmune antitumoral mejorada. De acuerdo con los hallazgos previos de los inventores sobre la salida vesicular de los parvovirus, es razonable suponer que el cotransporte de proteínas intracelulares a la superficie podría servir para desenmascarar células tumorales para una respuesta inmune del hospedador. Este efecto de carga asociada no está presente en ausencia de formación de viriones de la progenie usando la cepa aislada original de H1-PV (pSR-19) .

Compendio de la presente invención Con el proceso de adaptación (pases) en células semipermisivas, tal y como se indica en los ejemplos, se podría generar una variante de H1-PV competente en cuanto a la propagación, en muchas otras líneas celulares de glioblastoma humano. El procedimiento descrito se puede ampliar a otras células (líneas celulares) tumorales humanas que incluyen las células madre tumorales.

La adaptación del H1-PV de rata a células de glioblastoma humano condujo a una deleción en el extremo C-terminal de NS1/exón medio de NS2 de H1. Esta región representa un área clave para la variación que determina una gama de hospedadores de H1-PV y con adaptaciones/análisis adicionales de otras cepas aisladas de PV de roedor que hasta ahora no se han caracterizado, se pueden encontrar en esta zona variaciones adicionales.

Además de generar una variante de H1-PV que es potencialmente capaz de difundirse de célula a célula en tejido tumoral de glioblastoma humano y que, por lo tanto, tiene un mayor potencial para destruir células tumorales (tal y como se indica con los ensayos de aptitud) , las partículas de la progenie de esta cepa aislada se transportan activamente a la periferia de la célula a través de vesículas. Además de los... [Seguir leyendo]

1. Una variante de parvovirus de roedor capaz de propagarse y difundirse a través de células tumorales humanas, caracterizada porque la variante de parvovirus comprende (a) una deleción de 28 aminoácidos desde la posición 619 a 646 en el extremo C-terminal de NS1/desde la posición 126 a 153 en el exón medio de NS2 y (b) la sustitución de aminoácidos H374Y en VP1/2.

2. La variante de parvovirus según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las sustituciones de aminoácidos D391N y/o D439S.

3. La variante de parvovirus según la reivindicación 1 o 2, en donde la cepa de partida es un parvovirus de rata.

4. La variante de parvovirus según la reivindicación 3, que es un parvovirus H-1 de rata.

5. La variante de parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células tumorales son células de glioma.

6. La variante de parvovirus según la reivindicación 5, en la que el glioma es un glioblastoma.

7. Un ADN que codifica la variante de parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector de expresión que comprende el ADN según la reivindicación 7.

9. Una célula hospedadora que contiene la variante de parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el vector de expresión según la reivindicación 8.

10. Un anticuerpo dirigido contra la proteína NS1 de una variante de parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado adicionalmente porque solo se une a la proteína de la variante que tiene la deleción pero no a la proteína de tipo silvestre.

11. Kit que comprende:

(a) una variante de parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

(b) un ADN según la reivindicación 7;

(c) un anticuerpo según la reivindicación 10; y/u, opcionalmente,

(d) agentes auxiliares convencionales, tales como disolventes, tampones, vehículos, marcadores y testigos, en donde de los componentes (a) a (d) pueden estar presentes uno o varios representantes de cada uno.

12. Una composición farmacéutica que contiene (a) un parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el ADN según la reivindicación 7, el vector de expresión según la reivindicación 8, la célula hospedadora según la reivindicación 9 y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Uso de un parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el ADN según la reivindicación 7, el vector de expresión según la reivindicación 8, la célula hospedadora según la reivindicación 9, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer.

14. El parvovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el ADN según la reivindicación 7, el vector de expresión según la reivindicación 8, la célula hospedadora según la reivindicación 9, para uso en un método de tratamiento del cáncer.

15. El uso según la reivindicación 13 o 14, en el que dicho cáncer es un tumor cerebral.

16. El uso según la reivindicación 15, en el que dicho tumor cerebral es un glioma, un meduloblastoma, un meningioma o un glioblastoma.

Figura 8