Minitransposón miniUIB y usos derivados.

Minitransposón miniUIB y usos derivados.

La presente invención se refiere a un minitransposón que comprende las repeticiones invertidas izquierda y derecha de ISPst9,

a su uso para la transferencia de un ácido nucleico o para la mutagénesis aleatoria. Así mismo, la presente invención se refiere a un método para la transposición de un ácido nucleico desde una bacteria dadora a una bacteria receptora que comprende introducir el ácido nucleico a transponer entre las repeticiones invertidas del minitransposón de la invención, introducir el minitransposón en la bacteria dadora y conjugar ambas bacterias dadora y receptora.

La presente invención se refiere a un minitransposón denominado miniUIB y a su uso para la inserción genética. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la biotecnología.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los sistemas de inserción genética basados en minitransposones han demostrado ser los más simples y rápidos para insertar fragmentos de ADN en el cromosoma de la célula hospedadora. Estas herramientas biotecnológicas consisten en una secuencia de ADN flanqueada por las repeticiones invertidas (IRs) del transposón. Estas IRs son reconocidas por la transposasa, enzima codificada fuera de la estructura móvil, que es la responsable de movilizar la estructura IR-IR a otra región de ADN en el mismo u otro replicón.

Dado que el gen de la transposasa no es movilizado con el minitransposón, el resultado final del proceso es una inserción de ADN estable.

Los sistemas de minitransposición mini-Tn5 y mini-Tn10 (Herrero et al 1990 J. Bacteriol. 172:6557-6567; de Lorenzo et al 1990 J. Bacteriol. 172:6568-6572) son, con diferencia, los más usados. Sus aplicaciones 20 biotecnológicas residen en la simplicidad de sus estructuras genéticas junto con el sistema de replicación de plásmido suicida R6K (Kolter et al 1978 Cell 15:1199-1208) acoplado al sistema de conjugación RP4 de las cepas E. coli Apir (Miller y Mekalanos 1988 J. Bacteriol. 170: 2575-2583, Herrero et al 1990) . Desde entonces se les han introducido varias innovaciones de interés biotecnológico tales como el uso de nuevos determinantes de resistencia, la inserción de una replicasa R6K para facilitar la rápida 25 identificación de las regiones flanqueantes de la inserción (Rossignol et al 2001 Res. Microbiol. 152:481485) o la introducción del gen sacB para facilitar la pérdida del marcador de resistencia a antibiótico por recombinación homóloga (Li et al 2009 J. Microbiol. Methods 79:220-226) . A pesar de ello, la inestabilidad de las estructuras del minitransposón cuando se introduce un fragmento de ADN entre las IRs requiere del uso de plásmidos intermediarios para poder realizar correctamente las construcciones genéticas (Herrero et al 1990) . Adicionalmente, en algunas cepas receptoras, las frecuencias de transposición del sistema son tan bajas como las tasas de co-integración por recombinación homóloga del vector (Herrero et al 1990) .

ISPpu12 es una secuencia de inserción (IS) que se describió por primera vez en el plásmido TOL pWW0

de Pseudomonas putida mt-2 (Williams et al 2002 J. Bacteriol. 184:6572-6580) . Más adelante, se describió su presencia en P. stutzeri AN10 (Christie-Oleza et al 2010 J. Bacteriol. 192:1423-1432) y cómo esta IS era responsable de la fuerte activación de la transposición de las dos ISs de tipo ISL3 (ISPpu12 y ISPst9) en la mayor parte de las células de P. stutzeri AN10 que sufrían un proceso de interacción conjugativa (Christie-Oleza et al 2009 J. Bacteriol. 191:1239-1247) . En este sentido, se demostró que el

incremento de la transposición estaba regulado por TnpR, el regulador transcripcional codificado en el elemento ISPpu12. La activación de TnpR después de la conjugación incrementaba la transcripción del gene tnpA. La proteína sintetizada TnpA debería ser la responsable de la transposición de las dos ISs, ISPpu12 y ISPst9, ambas flanqueadas por IRs similares (Christie-Oleza et al 2010) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción génica que comprende las repeticiones invertidas izquierda y derecha de la secuencia de inserción ISPst9 de Pseudomonas stutzeri.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al uso de la construcción génica del primer aspecto de la invención para la transferencia de una secuencia nucleotídica de interés.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de la construcción génica del primer aspecto de la invención para la mutagénesis aleatoria.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método para la transposición de un ácido nucleico que comprende las siguientes etapas: (a) introducir el ácido nucleico a transponer entre las repeticiones invertidas de la construcción génica del primer aspecto de la invención; (b) introducir el ácido nucleico resultante de la etapa (a) en una bacteria dadora; y, (c) inducir la conjugación de la bacteria 60 dadora con una bacteria receptora.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención supone una nueva herramienta biotecnológica que permite la transposición de material genético entre dos células del dominio Bacteria. Esta herramienta es un minitransposón, que los inventores han denominado miniUIB. El minitransposón miniUIB presenta una alta eficiencia de transposición y es capaz de transponer secuencias de muy distintos tamaños, desde secuencias pequeñas de unos 500 pares de bases (pb) hasta secuencias grandes de hasta 12 kilobases (kb) . Además, la transposición conseguida gracias a miniUIB es una transposición estable. Esto implica que para insertar secuencias mayores a 12 kb se podría repetir el proceso tantas veces como sea necesario.

Los inventores han encontrado que el minitransposón miniUIB (construido a partir de las secuencias IRs de ISPst9 y basado en la transposición de la secuencia de inserción (IS) ISPpu12) es altamente eficaz a la hora de transponer de manera estable grandes fragmentos de ADN en cepas de P. stutzeri y en otras especies. Además, el minitransposón miniUIB mejora la eficiencia de transposición en comparación con el minitransposón mini-Tn5, el más comúnmente empleado hasta la fecha, y es útil en la transposición de material genético en una mayor variedad de bacterias que el mini-Tn5.

Los inventores han demostrado que el miniUIB es efectivo para conseguir la inserción de grandes fragmentos genéticos en un amplio rango de microorganismos receptores compatibles con el sistema de conjugación RP4.

En la presente descripción, los términos transposición y transferencia se usan indistintamente.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción génica que comprende las repeticiones invertidas izquierda y derecha de la secuencia de inserción ISPst9 de Pseudomonas stutzeri. Preferiblemente, la repetición invertida izquierda comprende SEQ ID NO: 1 y la repetición invertida derecha comprende SEQ ID NO: 2. Más preferiblemente, la repetición invertida izquierda consiste en SEQ ID NO: 1 y la repetición invertida derecha consiste en SEQ ID NO: 2.

Se entiende por construcción génica una secuencia nucleotídica construida mediante ingeniería genética uniendo distintas secuencias nucleotídicas de manera que la secuencia nucleotídica de la construcción génica no está presente como tal en la naturaleza, sino que es artificial. Se conocen en el estado de la técnica diversos métodos para la obtención de dichas construcciones génicas. Entre ellos están el diseño de cebadores con secuencia específica, la PCR, el uso de enzimas de restricción, etc, todos ellos bien conocidos por el experto en la materia.

Las repeticiones invertidas o secuencias repetidas inversas de una secuencia de inserción son pequeñas secuencias nucleotídicas que flanquean dicha secuencia de inserción. La secuencia de inserción ISPst9 de Pseudomonas stutzeri es una secuencia de inserción de tipo ISL3, y presenta dos repeticiones invertidas que flanquean la secuencia nucleotídica que codifica para la transposasa de dicha secuencia de inserción. Las secuencias de las dos repeticiones invertidas de ISPst9 tienen 24 pb y son idénticas. La secuencia de la repetición invertida izquierda es SEQ ID NO: 1 y la de la derecha es SEQ ID NO: 2, teniendo en cuenta la secuencia 5’-3’ de la construcción génica de la invención.

En una realización preferida del primer aspecto de la presente invención, la construcción génica comprende al menos una secuencia diana de una enzima de restricción entre las dos repeticiones 45 invertidas izquierda y derecha. Preferiblemente, dicha construcción comprende un sitio de multiclonación (MCS) entre las dos repeticiones invertidas izquierda y derecha. Preferiblemente, el MCS comprende entre 1 y 20 dianas de distintas enzimas de restricción, más preferiblemente entre 1 y 10 dianas, aún más preferiblemente entre 1 y 5 dianas.

Una secuencia diana de una enzima de restricción es la secuencia de ADN reconocida por una enzima con actividad hidrolasa específica, llamada enzima de restricción, que es capaz de hidrolizar dicha secuencia de ADN en un sitio específico determinado por la secuencia diana. Las secuencias dianas suelen ser palíndromos y el corte de la enzima... [Seguir leyendo]

1. Una construcción génica que comprende las repeticiones invertidas izquierda y derecha de la secuencia de inserción ISPst9 de Pseudomonas stutzeri. 5

2. La construcción génica según la reivindicación 1, donde la repetición invertida izquierda comprende SEQ ID NO: 1 y la repetición invertida derecha comprende SEQ ID NO: 2.

3. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la repetición invertida 10 izquierda consiste en SEQ ID NO: 1 y la repetición invertida derecha consiste en SEQ ID NO: 2.

4. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha construcción comprende al menos una secuencia diana de una enzima de restricción entre las dos repeticiones invertidas izquierda y derecha.

5. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicha construcción comprende un sitio de multiclonación entre las dos repeticiones invertidas izquierda y derecha.

6. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha construcción 20 comprende SEQ ID NO: 3.

7. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha construcción consiste en SEQ ID NO: 3.

8. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicha construcción está flanqueada por dos dianas de enzimas de restricción.

9. La construcción génica según la reivindicación 8, donde las dos dianas de enzimas de restricción son iguales. 30

10. La construcción génica según la reivindicación 8, donde las dos dianas de enzimas de restricción son distintas.

11. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicha construcción es 35 un vector.

12. La construcción génica según la reivindicación 11, donde dicho vector comprende un origen de replicación, al menos un gen de movilización, un sitio múltiple de clonación y/o al menos un gen de resistencia a antibiótico.

13. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, donde dicha construcción comprende SEQ ID NO: 4.

14. La construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde entre las repeticiones

invertidas izquierda y derecha dicha construcción comprende una secuencia nucleotídica de interés de entre 1 y 12.000 pares de bases.

15. La construcción génica según la reivindicación 14, donde la secuencia nucleotídica de interés tiene entre 500 y 2.000 pares de bases. 50

16. Uso de la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la transferencia de una secuencia nucleotídica de interés.

17. Uso según la reivindicación 16, donde la transferencia de la secuencia nucleotídica de interés se

hace en una célula del dominio Bacteria cuyo filo se selecciona entre: Proteobacteria, Actinobacteria y Firmicutes.

18. Uso según la reivindicación 17, donde la Proteobacteria es de la clase Alfaproteobacteria,

Betaproteobacteria o Gammaproteobacteria. 60

19. Uso según la reivindicación 18, donde la Proteobacteria es de la clase Gammaproteobacteria.

20. Uso según la reivindicación 19, donde la Gammaproteobacteria es del género Pseudomonas.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde se transfiere una única copia de la secuencia de interés.

22. Uso según la reivindicación 21, donde la Gammaproteobacteria es Escherichia coli.

23. Uso de la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la mutagénesis aleatoria.

24. Método para la transposición de una secuencia nucleotídica de interés que comprende las siguientes etapas: a) introducir la secuencia nucleotídica de interés a transponer entre las repeticiones invertidas de la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15; b) introducir la construcción génica resultante de la etapa (a) en una bacteria dadora; y,

c) inducir la conjugación de la bacteria dadora con una bacteria receptora.

25. Método según la reivindicación 24, donde la bacteria dadora es de la especie Escherichia coli y comprende la maquinaria de replicación del fago lambda.

26. Método según la reivindicación 25, donde la bacteria dadora es Escherichia coli S17.1 Apir.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde la bacteria receptora es Pseudomonas stutzeri.

FIGURAS

FIG. 1 FIG. 2 FIG. 3

FIG. 4 FIG. 5 FIG. 6 FIG. 7 FIG. 8