Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas.

Una meganucleasa recombinante que comprende:

un polipéptido que tiene al menos 85 % de similitud de secuencia con los restos 2-153 de la meganucleasa I-CreI de SEC ID Nº 1;

y

que tiene especificidad por un semisitio de secuencia de reconocimiento que difiere en al menos un par de bases de un semisitio dentro de una secuencia de reconocimiento de meganucleasa I-CreI seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 5;

en la que:

(1) la especificidad en la posición -1 se ha alterado:

(a) a una T en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en H139, Q46 y H46;

(b) a una A en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en Y139, C46 y A46;

(c) a una G en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en E46 y D46;

(d) a una C en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en 20 H46, K46 y R46; o

(e)a cualquier base en una cadena con sentido por la modificación G46; o

(2) la especificidad en la posición -3 se ha alterado:

(a) a una A en una cadena con sentido por la modificación C24;

(b) a una C en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en K24 y R24; o

(3) la especificidad en la posición -4 se ha alterado:

(a) a una C en una cadena con sentido por la modificación E77;

(b) a una G en una cadena con sentido por la modificación R77; o

(c) a una C o T en una cadena con sentido por la modificación S77; o

(4) la especificidad en la posición -5 se ha alterado:

(a) a una C en una cadena con sentido por la modificación E42;

(b) a una G en una cadena con sentido por la modificación R42; o

(c) a una A o G en una cadena con sentido por la modificación Q42; o

(5) la especificidad en la posición -6 se ha alterado:

(a) a una T en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en C40, I40, V40, C79, I79 y V79;

(b) a una C en una cadena con sentido por la modificación E40; o

(c) a una G en una cadena con sentido por la modificación R40.

Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas

APOYO GUBERNAMENTAL

La invención estuvo apoyada en parte por las subvenciones 2R01-GM-0498712, 5F32-GM072322 y 5 DP1 OD000122 del Instituto Nacional de las Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de América. Por lo tanto, el gobierno de Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo de la biología molecular y de tecnología de ácidos nucleicos recombinantes. En particular, la invención se refiere a meganucleasas de origen no natural diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia de reconocimiento de ADN alterada y/o afinidad alterada. La invención también se refiere a métodos para producir tales meganucleasas y métodos para producir ácidos nucleicos recombinantes y organismos que usan tales meganucleasas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La ingeniería genómica requiere la capacidad de insertar, suprimir, sustituir y manipular de otro modo secuencias genéticas específicas dentro de un genoma y tiene numerosas aplicaciones terapéuticas y biotecnológicas. El desarrollo de medios eficaces para modificación del genoma sigue siendo un objetivo importante en la terapia génica, agrotecnología y biología sintética (Porteus et al (2005) , Nat. Biotechnol. 23:967-73; Tzfira et al (2005) , Trends Biotechnol. 23:567-9; McDaniel et al (2005) , Curr. Opin. Biotechnol. 16:476-83) . Un método habitual para insertar o modificar una secuencia de ADN implica introducir una secuencia de ADN transgénico flanqueada por secuencias homólogas a la diana genómica y seleccionar o explorar con respecto a un acontecimiento de recombinación homóloga exitoso. La recombinación con el ADN transgénico se produce en pocas ocasiones pero puede estimularse por una rotura de doble cadena en el ADN genómico en el sitio diana. Se han empleado numerosos métodos para crear roturas de doble cadena de ADN, incluyendo irradiación y tratamientos químicos. Aunque estos métodos estimulan eficazmente la recombinación, las roturas de doble cadena se dispersan de forma aleatoria en el genoma, lo que puede ser altamente mutagénico y tóxico. En la actualidad, la incapacidad de dirigir modificaciones génicas a sitios únicos dentro de un fondo cromosómico es un impedimento importante para la ingeniería genómica exitosa.

Un enfoque para conseguir este objetivo es estimular la recombinación homóloga en una rotura de doble cadena en un locus diana usando una nucleasa con especificidad para una secuencia que es suficientemente grande para estar presente solamente en un sitio sencillo dentro del genoma (véase, por ejemplo, Porteus et al (2005) , Nat. Biotechnol. 23:967-73) . La eficacia de esta estrategia se ha demostrado en una diversidad de organismos usando fusiones quiméricas entre un dominio de unión de ADN de dedo de cinc obtenido por ingeniería genética y el dominio de nucleasa no específico de la enzima de restricción FokI (Porteus (2006) , Mol Ther 13:43846; Wright et al (2005) , Plant J. 44:693-705; Umov et al (2005) , Nature 435:646-51) . Aunque estas nucleasas de dedos de cinc artificiales estimulan la recombinación específica de sitio, conservan actividad de escisión no específica residual resultante de la baja regulación del dominio nucleasa y escinden frecuentemente en sitios no pretendidos (Smith et al. (2000) , Nucleic Acids Res. 28:3361-9) . Tal escisión no pretendida puede provocar mutaciones y toxicidad en el organismo tratado (Porteus et al (2005) , Nat. Biotechnol. 23:967-73) .

Un grupo de nucleasas de origen natural que reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases habitualmente hallados en los genomas de plantas y hongos puede proporcionar una alternativa de ingeniería genómica menos tóxica. Tales “meganucleasas” o “endonucleasas de búsqueda” se asocian frecuentemente con elementos de ADN parasitarios, tales como intrones de auto-corte y empalme de grupo 1 e inteínas. Promueven de forma natural la recombinación homóloga o inserción génica en localizaciones específicas en el genoma hospedador produciendo una rotura de doble cadena en el cromosoma, que recluta la maquinaria de reparación de ADN celular (Stoddard (2006) , Q. Rev. Biophys. 38:49-95) . Las meganucleasas se agrupan habitualmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de caja His-Cys y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales, que afectan a la actividad catalítica y secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG se caracterizan porque tienen una o dos copias del motivo LAGLIDADG conservado (véase Chevalier et al (2001) , Nucleic Acids Res 29 (18) : 3757-3774) . Las meganucleasas LAGLIDADG con una copia sencilla del motivo LAGLIDADG forman homodímeros, mientras que los miembros con dos copias del motivo LAGLIDADG se encuentran como monómeros. De forma similar, los miembros de la familia GIY-YIG tienen un módulo GIY-YIG, que es de 70-100 restos de longitud e incluye cuatro o cinco motivos de secuencia conservados con cuatro restos invariantes, dos de los cuales se requieren para actividad (véase Van Roey et al (2002) , Nature Struct. Biol. 9:806-811) . Las meganucleasas de caja His-Cys se caracterizan por una serie altamente conservada de histidinas y cisteínas sobre una región que abarca varios cientos de restos de aminoácidos (véase Chevalier et al (2001) , Nucleic Acids Res 29 (18) : 3757-3774) . En el caso de la familia NHN, los miembros se definen por motivos que contiene dos pares de histidinas conservadas rodeadas por restos de asparagina (véase Chevalier et al (2001) , Nucleic Acids Res 29 (18) : 3757-3774) . Las cuatro familias de meganucleasas están ampliamente separadas entre sí con respecto a elementos estructurales conservados y, en consecuencia, la especificidad de secuencia de reconocimiento de ADN y actividad catalítica.

Se han usado meganucleasas naturales, principalmente de la familia LAGLIDADG, para promover de forma eficaz la modificación genómica específica de sitio en plantas, levaduras, Drosophila, células de mamífero y ratones, pero este enfoque se ha limitado a la modificación de genes homólogos que conservan la secuencia de reconocimiento de meganucleasa (Monnat et al (1999) , Biochem. Biophys. Res Commun. 255:88-93) o genomas previamente modificados por ingeniería genética en los que se ha introducido una secuencia de reconocimiento (Rouet et al (1994) , Mol Cell. Biol. 14:8096-106; Chilton et al (2003) , Plant Physiol. 133:956 65; Puchta et al (1996) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5055-60; Rong et al (2002) , Genes Dev 16:1568-81; Gouble et al (2006) , J. Gene Med. 8 (5) :616-622) .

La implementación sistemática de modificación génica estimulada por nucleasas requiere el uso de enzimas modificadas por ingeniería genética con especificidades adaptadas para dirigir roturas de ADN a sitios existentes en un genoma y, por lo tanto, ha habido gran interés en la adaptación de meganucleasas para promover las modificaciones génicas en sitios médica o biotecnológicamente relevantes (Porteus et al (2005) , Nat. Biotechnol. 23:967-73; Sussman et al (2004) , J. Mol. Biol. 342:31-41; Epinat et al (2003) , Nucleic Acids Res 31:2952-62) .

La meganucleasa I-CreI de Chlamydomonas reinhardtii es un miembro de la familia LAGLIDADG que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases en el cromosoma de cloroplastos y que presenta una diana atractiva para rediseño de meganucleasas. La enzima de tipo silvestre es un homodímero en el que cada monómero entra en contacto directo con 9 pares de bases en la secuencia de reconocimiento de longitud completa. Se han usado técnicas de selección genética para identificar mutaciones en I-CreI que alteran la preferencia de bases en una posición sencilla en esta secuencia de reconocimiento (Sussman et al (2004) , J. Mol. Biol. 342:31-41; Chames et al. (2005) , Nucleic Acids Res 33: e178; Seligman et al (2002) , Nucleic Acids Res 30:3870-9) o, más recientemente, en tres posiciones en la secuencia de reconocimiento (Arnould et al (2006) , J. Mol Biol. 355:443-58) . La interfaz de ADN-proteína I-CreI contiene nueve aminoácidos que entran en contacto con las bases de ADN directamente y al menos cinco posiciones adicionales que pueden formar contactos potenciales en interfaces modificadas. El tamaño de esta interfaz impone una complejidad combinatoria de la que es poco probable tomar muestras de forma adecuada en bibliotecas de secuencias construidas para seleccionar con respecto a enzimas con sitios de escisión drásticamente alterados. Heath et al. describen la estructura de l-CreI,... [Seguir leyendo]

1. Una meganucleasa recombinante que comprende:

un polipéptido que tiene al menos 85 % de similitud de secuencia con los restos 2-153 de la meganucleasa I-CreI de SEC ID Nº 1; y que tiene especificidad por un semisitio de secuencia de reconocimiento que difiere en al menos un par de bases de un semisitio dentro de una secuencia de reconocimiento de meganucleasa I-CreI seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 5; en la que:

(1) la especificidad en la posición -1 se ha alterado:

(a) a una T en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en H139, Q46 y H46;

(b) a una A en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en Y139, C46 y A46;

(c) a una G en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en E46 y D46;

(d) a una C en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en H46, K46 y R46; o (e) a cualquier base en una cadena con sentido por la modificación G46; o

(2) la especificidad en la posición -3 se ha alterado:

(a) a una A en una cadena con sentido por la modificación C24;

(b) a una C en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en K24 y R24; o

(3) la especificidad en la posición -4 se ha alterado:

(a) a una C en una cadena con sentido por la modificación E77;

(b) a una G en una cadena con sentido por la modificación R77; o

(c) a una C o T en una cadena con sentido por la modificación S77; o

(4) la especificidad en la posición -5 se ha alterado:

(a) a una C en una cadena con sentido por la modificación E42;

(b) a una G en una cadena con sentido por la modificación R42; o

(c) a una A o G en una cadena con sentido por la modificación Q42; o

(5) la especificidad en la posición -6 se ha alterado:

(a) a una T en una cadena con sentido por una modificación seleccionada del grupo que consiste en C40, I40, V40, C79, I79 y V79;

(b) a una C en una cadena con sentido por la modificación E40; o

(c) a una G en una cadena con sentido por la modificación R40.

2. Un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente que incluye una secuencia exógena insertada en un cromosoma de dicha célula eucariota que comprende:

transfectar una célula eucariota con uno o más ácidos nucleicos incluyendo

(i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa, y

(ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que incluye dicha secuencia exógena;

en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho cromosoma y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma en dicho sitio de escisión; en el que dicha meganucleasa es una meganucleasa recombinante de la reivindicación 1; y en el que dicha célula eucariota no es una célula madre embrionaria humana.

3. Un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente que incluye una secuencia exógena insertada en un cromosoma de dicha célula eucariota, que comprende:

introducir una proteína meganucleasa en una célula eucariota; y transfectar dicha célula eucariota con un ácido nucleico que incluye dicha secuencia exógena;

en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho cromosoma y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma en dicho sitio de escisión; en el que dicha meganucleasa es una meganucleasa recombinante de la reivindicación 1; y en el que dicha célula eucariota no es una célula madre embrionaria humana.

4. Un método para producir una célula eucariota modificada genéticamente rompiendo una secuencia diana en un cromosoma de dicha célula eucariota que comprende:

transfectar una célula eucariota con un ácido nucleico que codifica una meganucleasa; en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho cromosoma y dicha secuencia diana se rompe por unión de extremos no homólogos en dicho sitio de escisión; en el que dicha meganucleasa es una meganucleasa recombinante de la reivindicación 1; y en el que dicha célula eucariota no es una célula madre embrionaria humana.

5. Un método para producir un organismo no humano modificado genéticamente que comprende:

producir una célula eucariota modificada genéticamente de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4; y cultivar dicha célula eucariota modificada genéticamente para producir dicho organismo modificado genéticamente.

6. Un método como en la reivindicación 5 en el que:

dicha célula eucariota se selecciona del grupo que consiste en un gameto, un cigoto, una célula blastocística, una célula madre embrionaria y una célula protoplástica.

7. Una meganucleasa recombinante de la realización 1 para su uso como un medicamento.

8. Un ácido nucleico aislado que codifica una meganucleasa recombinante de la reivindicación 1 para su uso como un medicamento.

9. Un método como en una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que:

dicho ácido nucleico comprende adicionalmente secuencias homólogas de secuencias que flanquean dicho sitio de escisión y dicha secuencia exógena se inserta en dicho sitio de escisión por recombinación homóloga;

o dicho ácido nucleico carece de homología sustancial con dicho sitio de escisión y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma por unión de extremos no homólogos.

10. Un medicamento como en una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, comprendiendo adicionalmente dicho medicamento:

un ácido nucleico aislado que incluye una secuencia exógena para insertar en un sitio de escisión en un cromosoma y secuencias que flanquean dicha secuencia exógena que son homólogas de secuencias que flanquean dicho sitio de escisión, en el que dicho sitio de escisión se escinde por dicha meganucleasa recombinante.

11. Uso de una meganucleasa recombinante de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar una infección por patógeno viral en un hospedador eucariota rompiendo una secuencia diana en un genoma de dicho patógeno viral, que comprende:

transfectar al menos una célula infectada de dicho hospedador eucariota con un ácido nucleico que codifica una meganucleasa; en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho genoma viral y dicha secuencia diana se rompe por unión de extremos no homólogos en dicho sitio de escisión; y en el que la rotura de dicha secuencia diana proporciona tratamiento para dicha infección.

12. Uso de una meganucleasa recombinante de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar una infección por patógeno viral en un hospedador eucariota rompiendo una secuencia diana en un genoma de dicho patógeno viral, que comprende:

transfectar al menos una célula infectada de dicho hospedador eucariota con un primer ácido nucleico que codifica una meganucleasa y un segundo ácido nucleico; en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho genoma viral y dicha secuencia diana se rompe por recombinación homóloga de dicho genoma viral y dicho segundo ácido nucleico en dicho sitio de escisión; en el que dicho segundo ácido nucleico comprende secuencias homólogas de secuencias que flanquean dicho sitio de escisión; y en el que la rotura de dicha secuencia diana proporciona tratamiento para dicha infección.

13. Uso de una meganucleasa recombinante de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar una infección por patógeno procariota en un hospedador eucariota rompiendo una secuencia diana en un genoma de dicho patógeno procariota, que comprende:

transfectar al menos una célula de dicho patógeno procariota que infecta dicho hospedador eucariota con un primer ácido nucleico que codifica una meganucleasa; en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho genoma procariota y dicha secuencia diana se rompe por unión de extremos no homólogos en dicho sitio de escisión; y en el que la rotura de dicha secuencia diana proporciona tratamiento para dicha infección.

14. Uso de una meganucleasa recombinante de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar una infección por patógeno procariota en un hospedador eucariota rompiendo una secuencia diana en un genoma de dicho patógeno procariota, que comprende:

transfectar al menos una célula de dicho patógeno procariota que infecta dicho hospedador eucariota con un primer ácido nucleico que codifica una meganucleasa y un segundo ácido nucleico; en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho genoma procariota y dicha secuencia diana se rompe por recombinación homóloga de dicho genoma procariota y dicho segundo ácido nucleico en dicho sitio de escisión; en el que dicho segundo ácido nucleico comprende secuencias homólogas de secuencias que flanquean dicho sitio de escisión; y en el que la rotura de dicha secuencia diana proporciona tratamiento para dicha infección.