Ligandos de cromatografía estables en medio cáustico.

Un ligando de cromatografía de afinidad estable en medio alcalino,

que comprende dos o más dominios C de la proteína A de Staphylococcus (SpA) unidos a un soporte sólido mediante una unión multipunto, en el que cada dominio C comprende una sustitución de glicina en la posición 29 con un aminoácido distinto de alanina, treonina o triptófano, en el que el dominio C comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 % con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:1 o está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 5, excepto la sustitución de la glicina en la posición 29, y en donde adicionalmente el ligando conserva al menos el 95 % de su capacidad de unión después de 5 horas de incubación en NaOH 0, 5 M.

Ligandos de cromatografía estables en medio cáustico

Campo de la invención La presente invención se refiere a ligandos de cromatografía que tienen estabilidad cáustica mejorada, por ejemplo, ligandos basados en proteínas de unión a inmunoglobulina tales como, proteína A Estafilocócica, así como a matrices de cromatografía que comprenden dichos ligandos.

Antecedentes Los ligandos utilizados en cromatografía de afinidad normalmente confieren una alta selectividad por la molécula diana, dando por lo tanto como resultando una purificación económica, rápida y a alto rendimiento de las moléculas diana. Los reactivos y las matrices de cromatografía basados en proteína A estafilocócica (SpA) han encontrado un amplio uso en el campo de la cromatografía de afinidad para la captura y purificación de anticuerpos así como en los procedimientos de detección de anticuerpos debido a su capacidad para unirse a IgG sin afectar significativamente a la afinidad de la inmunoglobulina por el antígeno.

Por consiguiente, se han desarrollado diversos reactivos y medios que comprenden ligandos basados en proteína A y se encuentran disponibles en el comercio, que incluyen, por ejemplo, ProSep®-vA High Capacity, ProSep® vA Ultra y ProSep® UltraPlus (Millipore) y Proteína A Sepharose™, MabSelect™, MabSelect Xtra™ y MabSelect SuRe® (GE Healthcare) y Poros Mab-Capture A™ (Applied Biosystems) .

Para conservar la selectividad y la capacidad de unión de los ligandos de cromatografía incluyendo, por ejemplo, resinas que incluyen ligandos de cromatografía basados en SpA, las resinas unidas al ligando, denominadas matrices de cromatografía, deben limpiarse y normalmente se limpian en condiciones alcalinas, por ejemplo, sin hidróxido de sodio. Por ejemplo, un procedimiento convencional que se usa para la limpieza y renovación de la matriz es un protocolo alcalino de limpieza en el sitio (CIP, por las siglas Cleaning-In-Place) , que normalmente implica el tratamiento de la matriz con NaOH 1 M, pH 14. Sin embargo, frecuentemente dicho tratamiento riguroso no es deseable, especialmente, cuando el ligando es una proteína o una molécula basada en proteínas.

El documento US 2006/0134805 A desvela la purificación de inmunoglobulinas.

Hober et al desvelan la cromatografía de Proteína A para la purificación de anticuerpos in Chromatography B, 848 (2007) 40-47.

El documento WO 03/080655 A desvela una proteína de unión a inmunoglobulina mutada.

El documento EP 0 550 771 A1 desvela la proteína artificial que se combina con inmunoglobulina.

Nilsson et al desvelan un dominio de unión a IgG sintético basado en la proteína A estafilocócica en Protein Engineering vol. no.2 págs. 107-113, 1987.

Jansson et al desvelan que todos los dominios individuales de la proteína A estafilocócica muestran unión a Fab en FEMS Immunology and Medical Microbiology 20 (1998) 69-78.

El documento EP 0 230 869 A desvela la construcción de una proteína de unión a IgG para facilitar el procesamiento aguas abajo usando modificación de proteínas por ingeniería genética.

El documento JP 2006 304 633 desvela aumento de estabilidad química en condiciones alcalinas de proteínas de unión a inmunoglobulina que contienen el dominio Z o el dominio C de unión a inmunoglobulina de la proteína A de Staphyloccocus, sustituyendo aminoácidos en posiciones específicas.

Sumario de la invención La presente invención proporciona ligandos de cromatografía basados en SpA estables en medio alcalino que pueden, por ejemplo, resistir ciclos repetidos de limpieza en el sitio (CIP) . Más específicamente, los ligandos de acuerdo con la invención pueden soportar la limpieza en medio alcalino convencional durante un periodo de tiempo prolongado, lo que hace que los ligandos sean candidatos atractivos, especialmente para la purificación de inmunoglobulinas a gran escala y rentable.

En un aspecto de la presente invención, un ligando de cromatografía estable en medio alcalino comprende dos o más dominios de SpA. Por ejemplo, en algunas realizaciones de acuerdo con este aspecto, se proporciona un ligando de cromatografía estable en medio alcalino que comprende dos o más dominios B o dos o más dominios Z de la proteína A de Staphyloccocus (SpA) , o un fragmento funcional o una variante del mismo, en el que los dos o más dominios B o los dos o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina.

En algunas realizaciones de acuerdo con este aspecto, el ligando comprende tres o más dominios B o tres o más dominios Z de SpA, o un fragmento funcional o una variante del mismo, en el que los tres o más dominios B o los tres o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina. En algunas otras realizaciones, el ligando comprende cuatro o más dominios B o cuatro o más dominios Z de SpA, en el que los cuatro o más dominios B o los cuatro o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina. En otras realizaciones más, el ligando comprende cinco o más dominios B o cinco o más dominios Z de SpA; o seis o más dominios B o seis o más dominios Z de SpA; o siete o más dominios B o siete o más dominios Z de SpA, en el que los cinco o más dominios B o los cinco o más dominios Z, o los seis o más dominios B, o los seis o más dominios Z, o los siete o más dominios B o los siete o más dominios Z están unidos a una resina de cromatografía en más de un sitio sobre la resina.

En otro aspecto de acuerdo con la presente invención, un ligando de cromatografía estable en medio alcalino comprende uno o más dominios aislados E, D, A, B, C o Z de la proteína A de Staphyloccocus, en el que el uno o más dominios aislados comprenden uno o más restos de aminoácidos mutados en la posición n+1 por cualquier aminoácido de origen natural excepto cisteína (C) , serina (S) , alanina (A) , glicina (G) , asparagina (N) o glutamina (Q) . En algunas realizaciones, n representa el resto de asparagina en la posición 23 de un dominio de SpA aislado.

En la Tabla I se muestran ligandos ejemplares que tienen una mutación en la posición 24 de un dominio de SpA aislado en el que n representa una asparagina.

Tabla I

Dominios SpA que incluyen modificaciones Denominación

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24M

sustituidos por metionina D-E24M

A-E24M

B-E24M

C-E24M

Z-E24M

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24I

sustituidos por isoleucina D-E24I

A-E24I

B-E24I

C-E24I

Z-E24I

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24F

sustituidos por fenilalanina D-E24F

A-E24F

B-E24F

C-E24F

Z-E24F

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24T

sustituidos por treonina D-E24T

A-E24T

B-E24T

C-E24T

Z-E24T

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24P

sustituidos por prolina D-E24P

A-E24P

B-E24P

C-E24P

Z-E24P

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24W

sustituidos por triptófano D-E24W

A-E24W

B-E24W

C-E24W

Z-E24W

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24R

sustituidos por arginina D-E24R

A-E24R

B -E24R

C-E24R

Z-E24R

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24V

sustituidos por valina D-E24V

A-E24V

B-E24V

C-E24V

Z-E24V

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24L

sustituidos por leucina D-E24L

A-E24L

B-E24L

C-E24L

Z-E24L

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24Y

sustituidos por tirosina D-E24Y

A-E24Y

B-E24Y

C-E24Y

Z-E24Y

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24H

sustituidos por histidina D-E24H

A-E24H

B-E24H

C-E24H

Z-E24H

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido aspártico en la posición 24 E-D24K

sustituidos por lisina D-E24K

A-E24K

B-E24K

C-E24K

Z-E24K

Dominio E, D, A, B, C o Z-ácido glutámico en la posición 24 o ácido... [Seguir leyendo]

1. Un ligando de cromatografía de afinidad estable en medio alcalino, que comprende dos o más dominios C de la proteína A de Staphylococcus (SpA) unidos a un soporte sólido mediante una unión multipunto, en el que cada dominio C comprende una sustitución de glicina en la posición 29 con un aminoácido distinto de alanina, treonina o triptófano, en el que el dominio C comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90 % con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:1 o está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 5, excepto la sustitución de la glicina en la posición 29, y en donde adicionalmente el ligando conserva al menos el 95 % de su capacidad de unión después de 5 horas de incubación en NaOH 0, 5 M.

2. El ligando de cromatografía estable en medio alcalino de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el grado de estabilidad caústica del ligando sigue en el orden de siete dominios C (C7) , es mayor de seis dominios C (C6) , es mayor de cinco dominios C (C5) , es mayor de cuatro dominios C (C4) , es mayor de tres dominios C (C3) , después de exposición del ligando a NaOH 0, 5 M durante al menos 5 horas 3. El ligando de cromatografía estable en medio alcalino de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende tres dominios C (C3) , o cuatro dominios C (C4) , o cinco dominios C (C5) , o seis dominios C (C6) o siete dominios C (C7) .

4. El ligando de cromatografía estable en medio alcalino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ligando puede unir al menos 1, 5 veces o 2 veces o 3 veces, o más IgG en comparación con la SpA natural (wt) , después de exposición del ligando a NaOH 0, 5 M durante al menos 5 horas.

5. El ligando de cromatografía estable en medio alcalino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en vidrio de poros controlados, poli (alcohol vinílico) , óxido de circonio, agarosa, polimetacrilato, poliacrilato, poliacrilamida y poliestireno.

6. Una matriz de cromatografía que comprende un ligando de cromatografía de afinidad estable en medio alcalino de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 30

7. Un procedimiento de purificación por afinidad de una o más inmunoglobulinas procedentes de una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) proporcionar una muestra que comprenda una o más inmunoglobulinas;

(b) poner en contacto la muestra con la matriz de la reivindicación 6, en condiciones tales que la una o más inmunoglobulinas se unan a la matriz; y

(c) recuperar la una o más inmunoglobulinas unidas eluyendo en condiciones adecuadas.

Figura 1 Secuencias de ADN de los dominios de unión a IgG naturales de la proteína A SEC ID Nº: l-Secuencia de ADN del dominio E

SEC ID Nº: 2-Secuencia de ADN del dominio D

SEC ID Nº: 3-Secuencia de ADN del dominio A

SEC ID Nº: 4 Secuencia de ADN del dominio B

SEC ID Nº: 5-Secuencia de ADN del dominio C

Figura 2

SEC ID Nº: 6-Secuencia de ADN del dominio Z

Figura 3

Alineamientos de las secuencias de los dominios de unión a IgG

Figura 4

SEC ID Nº: 12-Secuencia de aminoácidos del dominio Z

Figura 5

FIG. 6

Dominio B natural marcado con 6 histidinas (SEC ID Nº: 13)

E24M (SEC ID Nº: 14)

E24I (SEC ID Nº: 15)

E24F (SEC ID Nº: 16)

E24T (SEC ID Nº: 17)

E24P (SEC ID Nº: 18)

E24W (SEC ID Nº: 19)

E24R (SEC ID Nº: 20)

E24V (SEC ID Nº: 21)

E24L (SEC ID Nº: 22)

FIG. 6 Continuación E24Y (SEC ID Nº: 23)

E24H (SEC ID Nº: 24)

E24K (SEC ID Nº: 25)

E24D (SEC ID Nº: 26)

FIG.7

Dominio B natural marcado con 6 histidinas (SEC ID Nº: 27)

E24M (SEC ID Nº: 28)

E24I (SEC ID Nº: 29)

E24F (SEC ID Nº: 30)

E24T (SEC ID Nº: 31)

E24P (SEC ID Nº: 32)

E24W (SEC ID Nº: 33)

E24R (SEC ID Nº: 34)

FIG. 7 Continuación E24V (SEC ID Nº: 35)

E24L (SEC ID Nº: 36)

E24Y (SEC ID Nº: 37)

E24H (SEC ID Nº: 38)

E24K (SEC ID Nº: 39)

E24D (SEC ID Nº: 40)

Figura 8