Enriquecimiento e identificación de células fetales en sangre materna y ligandos para tal uso.

Método de detección de una célula fetal que comprende las etapas de

a.

proporcionar una muestra de sangre materna o una fracción de la misma

b. fijar las células

c. poner en contacto la muestra con

i. una sonda de hibridación dirigida a un ácido nucleico que comprende al menos 10 pb de un gen expresado de manera diferencial en células fetales de una muestra de sangre materna en el que el gen es TMEFF2 o

ii. un ligando dirigido a un antígeno codificado por un gen expresado de manera diferencial en células fetales de una muestra de sangre materna en el que el gen es TMEFF2.

Enriquecimiento e identificación de células fetales en sangre materna y ligandos para tal uso Antecedentes

El examen de células fetales para la detección temprana de enfermedades fetales y anomalías genéticas se lleva a 5 cabo en relación con muchos embarazos, en particular cuando la edad materna es alta (35 años o más) o cuando se conocen enfermedades genéticas en la familia. Pueden obtenerse células fetales mediante amniocentesis, la extracción de líquido amniótico de la cavidad amniótica dentro del saco amniótico o mediante biopsia coriónica, en la que se toman biopsias de la placenta, denominadas tomas de muestras invasivas.

El examen de aneuploidía prenatal emplea o bien análisis de cromosomas tradicional o bien sondas de ADN 1 específicas de cromosoma para el esclarecimiento de aberraciones numéricas de los cromosomas anómalos con mayor frecuencia, en particular de los cromosomas 13, 18, 21, X e Y en el feto.

Debido a la invasividad de los métodos de toma de muestras descritos anteriormente y al riesgo de aborto, sería ventajoso realizar el diagnóstico fetal mediante un procedimiento no invasivo, tal como por ejemplo mediante el uso de una muestra de sangre materna.

Durante el embarazo, una variedad de tipos celulares de origen fetal atraviesan la placenta y circulan dentro de la sangre periférica materna. La viabilidad de usar células fetales en la circulación materna para fines de diagnóstico se ha visto obstaculizada por el hecho de que las células fetales están presentes en la sangre materna sólo en números muy limitados, indicándose números de una célula fetal por 15-18 células maternas nucleadas o 1-1 células fetales por mi de sangre materna. Además, la mayoría de las células fetales no pueden distinguirse de las células 2 maternas basándose sólo en la morfología, por lo que se han investigado métodos de identificación de células fetales alternativos.

El documento US27/15171 describe un método no invasivo para el aislamiento y la detección de ADN fetal. El método enriquece una muestra de sangre materna usando anticuerpos que se unen específicamente a las células maternas y/o anticuerpos que se unen específicamente a las células fetales. Los inventores sugieren el uso de 25 algunos anticuerpos mencionados específicamente: HLe-1 es un anticuerpo que reconoce un antígeno presente sobre leucocitos humanos maduros y sobre precursores de eritrocitos muy inmaduros, pero no en eritrocitos nucleados maduros. Por tanto, se sugiere que puede usarse este anticuerpo para reconocer leucocitos maternos, pero no eritrocitos nucleados fetales. También se sugieren un anticuerpo anti-monocitos (M3) y un anticuerpo anti- ilnfocltos (L4) para extraer células maternas de una muestra. Finalmente, los autores sugieren usar un anticuerpo 3 monoclonal, que reconoce el receptor de transferrlna (TfR) sobre células fetales. Posteriormente se pone a disposición el ADN de células fetales aisladas para la detección y el diagnóstico.

El documento W26119569 proporciona en el ejemplo 7 un método para el mareaje de células fetales en células de sangre materna fijadas mediante el uso de un anticuerpo anti-telomerasa marcado.

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de métodos mejorados de aislamiento de células fetales a partir de 35 muestras de sangre materna tal como para facilitar la detección y el diagnóstico prenatales.

Sumario de la invención

La invención se define mediante las reivindicaciones 1-4.

Otro aspecto de la descripción se refiere a métodos de identificación y/o enriquecimiento de células fetales a partir de una muestra de sangre materna usando ARNm expresados preferentemente en células fetales y/o proteínas 4 codificadas por los ARNm. Tales métodos comprenden las etapas de

a. proporcionar una muestra de sangre materna o una fracción de la misma

b. poner en contacto la muestra con

i. una sonda de hibridación dirigida a un ácido nucleico que comprende al menos 1 pb de un gen seleccionado del grupo que consiste en TMEFF2, ABHD2, ACVR2B, ADAM11, AHNAK, AK42, ALS2CL, BC89454,

BC111482, CB12367, CCNA2, CD7, CPS1, CRYL1, D4ST1, DKFZp434F142, EDN1, EEF1A1,

ENST356196, FLJ3574, FYN, GCC2, GSK3A, HIST1H2AJ, HLA-C, HMGA1, HMGN2, ITGA7, KCNK4, KMO, KY, LOC389286, MAD2L1, MAPK3, MYL6, NBR2, NTRK1, PF4, PGK1, PPIA, QPRT, RGPD2, RP11- 78J21.1, RPL23, RPL23A, RPL26, RPL39, RPS27, SLAMF1, SYT9, T (BRACHYURY), THC226598, THC2274391, TP73, TPM3, UBL4A, WRN, ZFYVE9, ZNF283, ZNF539, ZNF614, CD141, CD135, CD142/F3, 5 CD146, CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4,

ACVR2B, ACVR2A, CD44v6+CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B o

ii. un ligando dirigido a un antígeno codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en TMEFF2,

ABHD2, ACVR2B, ADAM11, AHNAK, AK42, ALS2CL, BC89454, BC111482, CB12367, CCNA2, CD7, CPS1, CRYL1, D4ST1, DKFZp434F142, EDN1, EEF1A1, ENST356196, FLJ3574, FYN, GCC2, GSK3A, HIST1H2AJ, HLA-C, HMGA1, HMGN2, ITGA7, KCNK4, KMO, KY, LOC389286, MAD2L1, MAPK3, MYL6, NBR2, NTRK1, PF4, PGK1, PPIA, QPRT, RGPD2, RP11-78J21.1, RPL23, RPL23A, RPL26, RPL39, RPS27, SLAMF1, SYT9, T (BRACHYURY), THC226598, THC2274391, TP73, TPM3, UBL4A, WRN, ZFYVE9, ZNF283, ZNF539, ZNF614, CD141, CD135, CD142/F3, CD146, CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4, ACVR2B, ACVR2A, CD44v6+CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B.

Tras el enriquecimiento y/o la identificación, la(s) célula(s) fetal(es) normalmente se somete(n) a una etapa de detección, de manera que pueda realizarse una etapa de predicción y/o diagnóstico del feto.

Descripción

La presente descripción se basa en la identificación de ARNm que codifican para proteínas que se expresan preferentemente en células fetales de una muestra de sangre materna. Es decir, los ARNm están presentes en niveles aumentados en las células fetales en comparación con los niveles de ARNm en células de sangre materna. Por tanto, los ARNm identificados pueden usarse para la identificación de células fetales en una muestra de sangre materna mediante la detección o la cuantificación del ARNm o de la proteína codificada por el ARNm. Cuando se usa el término detección en el presente documento, cubre tanto detección como cuantificación. En dos realizaciones independientes, sin embargo, el término detección cubre o bien detección o bien cuantificación. Generalmente, el experto reconocerá cuándo detección también cubre cuantificación, es decir cuándo es relevante cuantificar los niveles de ARNm o los niveles de la proteína codificada por los ARNm. Esto puede ser necesario, por ejemplo, para la detección de un ARNm dado que se expresa a un nivel bajo en células maternas (pero no está ausente) y cuando el mismo ARNm se expresa por ejemplo a niveles 3 veces superiores en células fetales.

Un subconjunto de los ARNm codifican para proteínas expuestas en la superficie, y estas proteínas pueden usarse como antígenos para ligandos tales como aptámeros o anticuerpos y el uso de estos ligandos permite el enriquecimiento y/o la identificación de células fetales a partir de una muestra de sangre materna. Tal enriquecimiento es deseable porque las células fetales obtenidas de sangre materna pueden usarse para la detección y el diagnóstico prenatales.

Otro descubrimiento que los presentes inventores han hecho es que una etapa de fijación de las células de la muestra materna ayuda enormemente en la identificación y el enriquecimiento de las células fetales a partir de la muestra. Esta etapa de fijación puede realizarse junto con los métodos de enriquecimiento y/o identificación de células fetales descritos en el presente documento o junto con métodos de enriquecimiento y/o Identificación de células fetales que se han descrito en la técnica anterior (por ejemplo documento US27/15171 descrito en la sección de antecedentes).

Fijación de las células de una muestra de sanare materna

Un primer aspecto de la descripción se basa en el descubrimiento de que la fijación de las células de una muestra de sangre materna aumenta enormemente la estabilidad de células fetales en una muestra de sangre materna, mientras que permite el enriquecimiento y la identificación de células fetales por ejemplo tal como se describe adicionalmente en el segundo aspecto de la invención. El procedimiento de fijación puede realizarse en una muestra de sangre no enriquecida inmediatamente tras la toma de muestras, dando como resultado la fijación de todos los componentes celulares en la muestra de sangre materna. Al mismo tiempo, la fijación es tan leve que los eritrocitos... [Seguir leyendo]

Método de detección de una célula fetal que comprende las etapas de

a. proporcionar una muestra de sangre materna o una fracción de la misma

b. fijar las células

c. poner en contacto la muestra con

i. una sonda de hibridación dirigida a un ácido nucleico que comprende al menos 1 pb de un gen expresado de manera diferencial en células fetales de una muestra de sangre materna en el que el gen es TMEFF2 o

ii. un ligando dirigido a un antigeno codificado por un gen expresado de manera diferencial en células fetales de una muestra de sangre materna en el que el gen es TMEFF2.

Método según la reivindicación 1, que comprende además una etapa de identificación de células fetales de la muestra o una etapa de enriquecimiento de células fetales de la muestra.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la identificación comprende detectar la presencia del ligando o la sonda de hibridación sobre o en las células fetales.

Método según la reivindicación 2, en el que el enriquecimiento comprende poner en contacto la muestra de sangre materna con un ligando dirigido a un antigeno expuesto en la superficie celular codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en tomorregulina, EDN1, AFINAK, CD 15, SYT 9, KMO, FIMGA1, T de ratón, ACVR2B, CD141, CD135, CD142/F3, CD146, CD33, CD68, CD144, CD62E, GAP/GJA5, ITGA5, KCNK3/TASK-1, CNTFR, JAM-1, SDC4/Syndecan 4, ACVR2B, ACVR2A, CD44v6+CD44v4/5, STX1A, TEK/Tie2, CD171, NCAM/CD56, ALPP, ALPPL2 y MMP23A/MMP23B.