Método para la identificación y la cuantificación de cambios en la expresión de ácidos nucleicos, variantes de corte y empalme, translocación, número de copias o metilación.

Un método para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácidos nucleicos que contienen una secuencia de nucleótidos diana que difiere de las secuencias de nucleótidos de otras moléculas de ácidos nucleicos de la muestra,

5 o de otras muestras, en uno o más nucleótidos, uno o más números de copias, una o más secuencias de transcritos, y/o uno o más restos metilados, comprendiendo dicho método:

proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de ácidos nucleicos que contienen potencialmente la secuencia de nucleótidos diana que difiere de las secuencias de nucleótidos de otras moléculas de ácidos nucleicos en uno o más nucleótidos, uno o más números de copias, una o más secuencias de transcritos y/o uno o más restos metilados;

proporcionar una o más enzimas capaces de digerir las moléculas de ácidos nucleicos que contienen desoxiuracilo (dU) en la muestra;

proporcionar uno o más conjuntos de cebadores de oligonucleótidos primarios, comprendiendo cada conjunto de cebadores de oligonucleótidos primarios (a) un primer cebador de oligonuclótidos primario que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia adyacente a la secuencia de nucleótidos diana y (b) un segundo cebador de oligonuclótidos primario que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una parte de un producto de extensión formado a partir del primer cebador de oligonuclótidos primario;

combinar la muestra, el uno o más conjuntos de cebadores de oligonucleótidos primarios, la una o más enzimas capaces de digerir las moléculas de ácidos nucleicos que contienen desoxiuracilo (dU) en la muestra, una mezcla de desoxinucleótidos, que incluye dUTP, y una ADN polimerasa para formar una mezcla de la reacción en cadena de la polimerasa;

someter la mezcla de la reacción en cadena de la polimerasa a condiciones adecuadas para digerir las moléculas de ácidos nucleicos que contienen desoxiuracilo (dU) presentes en la mezcla de la reacción en cadena de la polimerasa, y uno o más ciclos de reacción en cadena de la polimerasa que comprenden un tratamiento de desnaturalización, un tratamiento de hibridación y un tratamiento de extensión, formando así productos de extensión primarios que comprenden la secuencia de nucleótidos diana o un complemento de la misma; combinar los productos de extensión primarios con una ligasa y uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótidos para formar una mezcla de reacción de ligadura, en donde cada conjunto de sondas de oligonucleótidos comprende

(a) una primera sonda de oligonucleótidos que tiene un porción específica del cebador en 5' y una porción específica de la secuencia de nucleótidos diana en 3', y (b) una segunda sonda d oligonucleótidos que tiene un porción específica de la secuencia de nucleótidos diana en 5' y una porción específica del cebador en 3' y en donde la primera y la segunda sondas de nucleótidos de un conjunto de sondas están configuradas para hibridarse, de forma específica de la base, sobre una secuencia de nucleótidos diana complementaria de un producto de extensión primario;

someter la mezcla de la reacción de ligadura a uno o más ciclos de reacción de ligadura, por lo cual, la primera y la segunda sondas de oligonucleótidos del uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótidos se ligan entre sí para formar secuencias de productos ligadas en la mezcla de reacción de ligadura en donde cada secuencia de producto ligada comprende la porción específica del cebador en 5', las porciones específicas de la diana y la porción específica del cebador en 3';

proporcionar uno o más conjuntos de cebadores de oligonucleótidos secundarios, comprendiendo cada conjunto de cebadores de oligonucleótidos secundarios (a) un primer cebador de oligonucleótidos secundarios que comprende la misma secuencia de nucleótidos que la porción específica del cebador en 5' de la secuencia del producto ligada y (b) un segundo cebador de oligonucleótidos secundarios que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la porción específica del cebador en 3' de la secuencia del producto ligada; combinar las secuencias de productos ligadas, el uno o más conjuntos de cebadores de oligonucleótidos secundarios, la una o más enzimas capaces de digerir las moléculas de ácidos nucleicos que contienen desoxiuracilo (dU), una mezcla de desoxinucleótidos que incluye dUTP y una ADN polimerasa para formar una segunda mezcla de reacción en cadena de la polimerasa;

someter la segunda mezcla de la reacción en cadena de la polimerasa a condiciones adecuadas para digerir las moléculas de ácidos nucleicos que contienen desoxiuracilo (dU) presentes en la mezcla de la reacción en cadena de la polimerasa, y en uno o más ciclos de reacción en cadena de la polimerasa que comprenden un tratamiento de desnaturalización, un tratamiento de hibridación y un tratamiento de extensión, formando de esta manera productos de extensión secundarios; y

detectar y distinguir los productos de extensión secundarios en la muestra para identificar la presencia de una o más moléculas de ácidos nucleicos que contienen secuencias de nucleótidos diana que difieren de las secuencias de nucleótidos en otras moléculas de ácidos nucleicos de la muestra en uno o más nucleótidos, uno o más números de copias, una o más secuencias de transcritos, y/o uno o más restos metilados.