Detección de un ácido nucleico diana y variantes.

Un método para la detección de la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos diana o la detección de la presencia de una secuencia variante en una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra,

que comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra que comprende ácidos nucleicos de molde

b) proporcionar un conjunto de cebadores que comprende al menos un par de cebadores específicamente capaces de la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos diana, en donde el conjunto de cebadores al menos comprende un cebador H y un cebador L, en donde la temperatura de fusión de cebador H es al menos 16 °C mayor, tal como al menos 20 °C mayor, que la temperatura de fusión del cebador L y en donde el cebador L contiene una secuencia complementaria de un fragmento del producto de elongación de cebador H,

c) proporcionar una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad de polimerasa a una temperatura de elongación,

d) preparar reacciones de PCR divididas que comprenden cada una de ellas una parte de la muestra, el conjunto de cebadores, la polimerasa de ácido nucleico, reactivos de PCR y opcionalmente reactivos de detección

e) llevar a cabo una reacción de polimerasa incremental asimétrica (AIPR) que comprende las etapas de:

i. incubar las reacciones de PCR divididas a la temperatura de desnaturalización, lo que desnaturaliza así el ADN en moléculas monocatenarias

ii. incubar las reacciones de PCR divididas a una elevada temperatura de hibridación que permite la hibridación del cebador H, pero no del cebador L,

iii. opcionalmente incubar las reacciones de PCR divididas a la temperatura de elongación, iv. opcionalmente repetir las etapas i a iii,

v. amplificar así solo una cadena de la secuencia de ácidos nucleicos diana

f) llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende las etapas de:

1) incubar las reacciones de PCR divididas a la temperatura de la desnaturalización, lo que desnaturaliza así el ADN en moléculas monocatenarias

2) incubar la PCR a una baja temperatura de hibridación que permite la hibridación tanto del cebador H como del cebador L,

3) incubar la PCR a la temperatura de elongación, lo que permite así la extensión de los cebadores alineados

4) opcionalmente repetir las etapas II a IV,

5) amplificar así ambas cadenas de la secuencia de ácidos nucleicos diana para obtener un producto de PCR

g) detectar si el producto de PCR comprende la secuencia de ácidos nucleicos diana o la secuencia variante en la secuencia de ácidos nucleicos diana.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2016/061121.

Solicitante: Saga Diagnostics AB.

Nacionalidad solicitante: Suecia.

Dirección: Scheelevägen 2, MV-406 223 81 Lund SUECIA.

Inventor/es: SAAL,LAO HAYAMIZU, GEORGE,ANTHONY MILES.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/686
  • C12Q1/6886

PDF original: ES-2775551_T3.pdf

 

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