Análisis de enriquecimiento de substrato de quinasa.

Un método in vitro para determinar la activación diferencial de una enzima en una primera muestra biológica con respecto a una segunda muestra biológica,

en donde la enzima cataliza una reacción que implica la adición de un grupo funcional a una proteína o péptido, comprendiendo el método:

(1) agrupar los péptidos modificados endógenos de la primera muestra biológica y los péptidos modificados endógenos de la segunda muestra biológica en un único grupo de acuerdo con uno de los siguientes parámetros:

* péptidos modificados endógenos que tienen un sitio de modificación que es modificado por la misma enzima; o

* péptidos modificados endógenos que tienen un sitio de modificación que es parte de la misma secuencia específica de aminoácidos que se modifica en la misma posición por la misma enzima;

(2) calcular el enriquecimiento de los péptidos modificados endógenos de la primera muestra biológica en comparación con los péptidos modificados endógenos de la segunda muestra biológica en el grupo, en el que se compara el aumento en abundancia o frecuencia de los péptidos modificados endógenos de la primera muestra biológica el aumento o disminución en la abundancia o frecuencia de los péptidos modificados endógenos de la segunda muestra biológica; y

(3) calcular el significado estadístico de dicho enriquecimiento;

en el que un enriquecimiento estadísticamente significativo es indicativo de que la enzima se activa en la primera muestra biológica en comparación con la segunda muestra biológica, y en el que el método comprende además identificar péptidos modificados endógenos en la primera muestra biológica y la segunda muestra biológica usando espectrometría de masas (MS) antes de la etapa (1), en el que la identificación de péptidos modificados endógenos en cada una de la primera muestra biológica y la segunda muestra biológica se lleva a cabo usando un método que comprende las siguientes etapas:

(a) obtener péptidos endógenos a partir de la muestra biológica;

(b) añadir péptidos modificados de referencia en una cantidad conocida a los péptidos obtenidos en la etapa (a) para producir una mezcla de péptidos endógenos y péptidos modificados de referencia;

(c) llevar a cabo espectrometría de masas (MS) en dicha mezcla de péptidos endógenos y péptidos modificados de referencia y normalizar la señal de los péptidos modificados endógenos a la señal de los péptidos modificados de referencia para obtener datos relativos a los péptidos endógenos en la muestra biológica; y

(d) comparar los datos relacionados con los péptidos endógenos en la muestra biológica con datos en una base de datos de péptidos modificados utilizando un programa informático;

en el que la base de datos de péptidos modificados se compila por un método que comprende:

i obtener péptidos a partir de una muestra biológica;

ii enriquecer péptidos modificados a partir de los péptidos obtenidos en el paso i;

iii realizar cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) sobre los péptidos modificados enriquecidos obtenidos en la etapa ii;

iv comparar los péptidos modificados detectados en la etapa iii con una base de datos de referencia conocida para identificar los péptidos modificados; y

v compilar datos relacionados con los péptidos modificados identificados en el paso iv en una base de datos.