Utilización mejorada de xilosa en bacterias Zymomonas recombinantes que presentan una actividad ribosa-5-fosfato aumentada.

Una célula huésped bacteriana recombinante que comprende:

a) una ruta metabólica de la xilosa que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa;

b) al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa; y

c) al menos una modificación genética que aumenta la expresión de la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped en comparación con la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped que carece de dicha modificación genética;

en donde la célula huésped bacteriana utiliza xilosa para producir etanol, y en donde la célula huésped bacteriana es seleccionada del grupo que consiste en Zymomonas y Zymobacter, y en donde la al menos una modificación genética de la operación (c) comprende aumentar el número de copias génicas de un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa y/o hacer que se exprese dicho gen que codifica ribosa-5-fosfato isomerasa a partir de un promotor de alta expresión.

Utilización mejorada de xilosa en bacterias Zymomonas recombinantes que presentan una actividad ribosa-5-fosfato aumentada Campo de la invención La invención se refiere a los campos de la microbiología y la ingeniería genética. Más específicamente, el aumento de la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en bacterias Z. mobilis que utilizan xilosa mejoró la utilización de xilosa por el microorganismo.

Antecedentes de la invención La producción de etanol por microorganismos proporciona una fuente de energía alternativa a los combustibles fósiles y, por lo tanto, es un área importante de la investigación actual. Es deseable que los microorganismos que producen etanol, así como otros productos útiles, sean capaces de utilizar xilosa como una fuente de carbono ya que la xilosa es la pentosa principal en la biomasa lignocelulósica hidrolizada. La biomasa puede proporcionar un sustrato carbonado de bajo coste y abundantemente disponible. La bacteria Zymomonas mobilis y otras bacterias etanologénicas que no utilizan xilosa de forma natural han sido genéticamente modificadas en cuanto a la utilización de xilosa mediante la introducción de genes que codifican 1) xilosa isomerasa, que cataliza la conversión de xilosa en xilulosa; 2) xilulocinasa, que fosforila la xilulosa para formar xilulosa-5-fosfato; 3) transcetolasa; y 4) transaldolasa.

Ha habido éxito en la modificación de cepas de Z. mobilis en cuanto al metabolismo de la xilosa [ (Documentos US 5514583, US 5712133, US 6566107 y WO 95/28476; Feldmann et al. (1992) , Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 354361; Zhang et al. (1995) , Science 267: 240-243], así como una cepa de Zymobacter palmae [Yanase et al. (2007) , Appl. Environ. Microbiol. 73: 2592-2599]. Sin embargo, típicamente, las cepas modificadas no crecen ni producen etanol tan bien sobre xilosa como sobre glucosa. Las cepas modificadas para la utilización de xilosa han sido adaptadas mediante subcultivos sucesivos sobre medio de xilosa para dar lugar a cepas con una utilización mejorada de xilosa, como se describe en la Patente de EE.UU. nº 7.223.575 y en la Patente de EE.UU. nº 7.741.119 en propiedad común y tramitación con la presente. En la Solicitud de Patente de EE.UU. nº US 2009-0246846 A1, en propiedad común y tramitación con la presente, se describe el hallazgo de que una cepa adaptada con mayor utilización de xilosa presenta una actividad xilosa isomerasa aumentada, y la modificación para una utilización mejorada de xilosa mediante la expresión de xilosa isomerasa a partir de un promotor mutado y muy activo (Pgap) del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Zymomonas mobilis. Sin embargo, la utilización de xilosa no es todavía comparable a la utilización de glucosa.

Sigue habiendo la necesidad de cepas de Zymomonas, y de otras bacterias etanologénicas, que presenten una mejora adicional en la utilización de xilosa.

Sumario de la invención La invención proporciona células de Zymomonas o Zymobacter que producen etanol y utilizan xilosa recombinantes, que son modificadas para que presenten una actividad ribosa-5-fosfato isomerasa (RPI) aumentada. Se ha descubierto que, en cepas cuya actividad xilosa isomerasa es elevada, el flujo de carbono a la RPI es también elevado y da lugar a la generación de los subproductos indeseables ribulosa-5 fosfato y/o ribulosa (catalizada por fosfatasas celulares) , que se acumulan en el medio. La generación de estos subproductos desvía el carbono que se podría utilizar en la producción de etanol. La solución de los solicitantes a este problema recién descubierto es aumentar la actividad de la RPI para dirigir más carbono a los productos deseados de la ruta metabólica de la xilosa (fructosa-6-fosfato y gliceraldehído-6-fosfato) que se utilizan en la generación de etanol. De este modo, en cepas de Zymomonas o Zymobacter que utilizan xilosa, que acumulan ribulosa-5-fosfato y/o ribulosa cuando se cultivan en un medio que contiene xilosa, un aumento de la actividad RPI mejora el crecimiento celular, la utilización de xilosa y la producción de etanol.

En consecuencia, la invención proporciona una célula huésped bacteriana recombinante que comprende:

a) una ruta metabólica de la xilosa que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa;

b) al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa; y

c) al menos una modificación genética que aumenta la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped en comparación con la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped que carece de dicha modificación genética;

en donde la célula huésped bacteriana utiliza xilosa para producir etanol, y en donde la célula huésped bacteriana es seleccionada del grupo que consiste en Zymomonas y Zymobacter, y en donde la al menos una modificación genética de la operación (c) comprende aumentar el número de copias génicas de un gen que codifica un

polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa y/o hacer que se exprese dicho gen que codifica ribosa-5-fosfato isomerasa a partir de un promotor de alta expresión.

La ribosa-5-fosfato isomerasa de la invención puede ser del tipo "A" o del tipo "B", como se describen en esta memoria. Las ribosa-5-fosfato isomerasas del tipo "A" preferidas son aquellas que:

i) proporcionan una puntuación del valor E de 0, 1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 y 97; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones, y

ii) tienen ácido aspártico y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 107 y 129, respectivamente, en la proteína RPI-A de Saccharomyces cerevisiae de ID. SEC. nº 97.

Similarmente, las ribosa-5-fosfato isomerasas del tipo "B" preferidas son aquellas que:

i) proporcionan una puntuación del valor E de 0, 1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 1213, 1214, 1215, 1216 y 1217; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones,

ii) o bien tienen cisteína y treonina en las posiciones que corresponden a 66 y 68, respectivamente, en la proteína RPI-B de E. coli de ID. SEC. nº 1216, o bien tienen serina y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 68 y 72, respectivamente, en la proteína RPI-B de M. tuberculosis de ID. SEC. nº 1213, y

iii) tienen asparagina, glicocola, ácido aspártico, serina o ácido glutámico, pero no leucina, en la posición que corresponde a 100 en la proteína RPI-B de E. coli de ID. SEC. nº 1216.

Las xilosa isomerasas preferidas para uso en la invención son aquéllas que tienen una puntuación del valor E inferior o igual a 3x10-10 cuando se hace la búsqueda empleando un perfil HMM preparado usando las ID. SEC. números 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81 y que tienen cuatro restos de sitio catalítico: histidina 54, ácido aspártico 57, ácido glutámico 181 y lisina 183, con los números de posición en relación con la secuencia de xilosa isomerasa de Streptomyces albus de ID. SEC. nº 61.

Un método para preparar una célula huésped bacteriana recombinante para la producción de etanol puede comprender:

a) proporcionar una célula huésped de bacteria Zymomonas o Zymobacter que comprende una ruta metabólica de la xilosa, en donde la célula huésped bacteriana produce etanol en presencia de xilosa y acumula ribulosa-5-fosfato, ribulosa o ambas, ribulosa-5-fosfato y ribulosa, en el medio cuando se cultiva en un medio que comprende xilosa; y

b) modificar genéticamente la célula huésped bacteriana de (a) , en donde la modificación genética aumenta la expresión de la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped en comparación con la actividad ribosa-5fosfato isomerasa en la célula huésped que carece de dicha modificación genética, en donde dicha modificación comprende aumentar el número de copias génicas de un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa y/o hacer que se exprese dicho gen de ribosa-5-fosfato isomerasa a partir de un promotor de alta expresión, y en donde ya no se acumulan ribulosa-5-fosfato, ribulosa ni ambas, ribulosa-5-fosfato y ribulosa, en el medio.

En otra realización, la invención proporciona un proceso para producir etanol, que comprende:

a) proporcionar una célula... [Seguir leyendo]

1. Una célula huésped bacteriana recombinante que comprende:

a) una ruta metabólica de la xilosa que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa;

b) al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa; y

c) al menos una modificación genética que aumenta la expresión de la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped en comparación con la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped que carece de dicha modificación genética;

en donde la célula huésped bacteriana utiliza xilosa para producir etanol, y en donde la célula huésped bacteriana es seleccionada del grupo que consiste en Zymomonas y Zymobacter, y en donde la al menos una modificación genética de la operación (c) comprende aumentar el número de copias génicas de un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa y/o hacer que se exprese dicho gen que codifica ribosa-5-fosfato isomerasa a partir de un promotor de alta expresión.

2. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 1, en donde la al menos una modificación genética de la operación (c) es

(i) sobreexpresión de un gen endógeno que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa, y/o

(ii) expresión de al menos un gen no endógeno que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa.

3. El microorganismo recombinante de la Reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa tiene la clasificación de la EC: EC 5.3.1.6.

4. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 3, en donde el polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa es seleccionado del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa A y ribosa-5fosfato isomerasa B.

5. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde el polipéptido ribosa-5-fosfato isomerasa A:

i) proporciona una puntuación del valor E de 0, 1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 y 97; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones, y

ii) tiene ácido aspártico y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 107 y 129, respectivamente, en la proteína RPI-A de Saccharomyces cerevisiae de ID. SEC. nº 97.

6. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde la ribosa-5-fosfato isomerasa A tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 83 a 1212 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0, 1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas, en donde la ribosa-5-fosfato isomerasa A tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 y 97 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0, 1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas.

7. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde el polipéptido ribosa-5-fosfato isomerasa B:

i) proporciona una puntuación del valor E de 0, 1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 1213, 1214, 1215, 1216 y 1217; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones;

ii) o bien tiene cisteína y treonina en las posiciones que corresponden a 66 y 68, respectivamente, en la proteína RPI-B de E. coli de ID. SEC. nº 1216, o bien tiene serina y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 68 y 72, respectivamente, en la proteína RPI-B de M. tuberculosis de ID. SEC. nº 1213; y

iii) tiene asparagina, glicocola, ácido aspártico, serina o ácido glutámico, pero no leucina, en la posición que corresponde a 100 en la proteína RPI-B de E. coli de ID. SEC. nº 1216.

8. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde la ribosa-5-fosfato isomerasa B tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 1213 a 2107 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0, 1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas, en donde la ribosa-5-fosfato isomerasa B tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 1213, 1214, 1215, 1216 y 1217 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0, 1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas.

9. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho microorganismo comprende además al menos una modificación genética que aumenta la actividad xilosa isomerasa en comparación con la actividad xilosa isomerasa en el microorganismo que carece de dicha modificación genética.

10. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde el gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa está sobreexpresado.

11. El microorganismo recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde el gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa se expresa en múltiples copias.

12. La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, en donde el polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa es seleccionado de entre:

(i) una proteína que tiene una puntuación del valor E inferior o igual a 3x10-10 cuando se hace la búsqueda empleando un perfil HMM preparado usando las ID. SEC. números 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81 y que tiene cuatro restos de sitio catalítico: histidina 54, ácido aspártico 57, ácido glutámico 181 y lisina 183, con los números de posición en relación con la secuencia de xilosa isomerasa de Streptomyces albus de ID. SEC. nº 61; y

(ii) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0, 1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas.

13. Un proceso para producir etanol, que comprende:

a) proporcionar una célula huésped bacteriana recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12; y

b) cultivar la célula huésped bacteriana de (a) en un medio que comprende xilosa, mediante lo cual se convierte la xilosa en etanol.

14. El proceso de la Reivindicación 13, en donde la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa es la actividad de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa A y ribosa-5-fosfato isomerasa B.

15. El proceso de la Reivindicación 14, en donde el medio comprende o bien una mezcla de azúcares que incluye xilosa o bien xilosa como único azúcar.