Uso de L. casei subsp. paracasei como anti-fúngico.

Uso de una bacteria de la especie L. casei subsp. paracasei para conferir propiedades anti-fúngicas a un producto lácteo fermentado,

dicha bacteria de la especie L. casei subsp. paracasei que es una bacteria de la cepa CNCM I-1518.

Uso de L. casei subsp. paracasei como anti-fúngico

La presente invención se refiere al uso de la cepa CNCM 1-1518 de Lactobacillus casei para proteger un producto lácteo contra el crecimiento de mohos.

El uso de microorganismos seleccionados con el fin de mejorar la conservación de los alimentos se conoce desde hace milenios. Entre estos microorganismos, se pueden mencionar bacterias del ácido láctico, que son ampliamente 1 usadas para la conservación de productos lácteos, productos cárnicos o productos de origen vegetal destinados al consumo humano o animal. La mejora en la conservación de alimentos por las bacterias del ácido láctico se basa en gran medida en su capacidad para producir ácido láctico y otros ácidos orgánicos durante la fermentación que inhiben el crecimiento de microorganismos no deseables (bacterias y mohos) mediante la reducción del pH del medio, que es desfavorable para el crecimiento de estos microorganismos, y/o que tiene un efecto tóxico directo 15 sobre ellos. Además de estos ácidos orgánicos, algunas bacterias del ácido láctico producen sustancias anti- fúngicas y/o anti-bacterianas, tales como peróxido de hidrógeno, diacetilo, o nisina.

La Solicitud EP 221499 describe las propiedades anti-fúngicas de Lactobacillus casei subsp. rhamnosus NRRL-B- 15972. Cuando esta bacteria se cultiva en medio de agar suplementado con jugo de pepino, es capaz de inhibir 2 completamente el crecimiento de Chaetomium olivacium, e inhibir parcialmente el de Aspergillus terreus y Verticillium sp. Sin embargo, en estas condiciones, no tiene ningún efecto sobre el crecimiento de Penicillium oxalicurrr, no obstante se observa un efecto inhibitorio sobre este microorganismo con cultivos de estas bacterias en jugo de pepino a un pH de 3,7 aproximadamente.

La Solicitud EP 57678 describe los efectos anti-fúngicos de Lactobacillus casei subsp. rhamnosus LC-75. Los cultivos de esta bacteria, obtenidos en un medio a base de suero de la leche, complementado con hidrolizado de caseína y extracto de levadura pueden inhibir el crecimiento de Penicillium, Cladosporium, Fusarium y Candida.

La Solicitud PCT WO 97/3663 describe los efectos anti-fúngicos de Lactobacillus casei subsp. casei N94/49432. 3 Cultivos de esta bacteria, que se obtienen en un medio sintético suplementado con extracto de levadura, tienen un efecto anti-fúngico sobre Alternaría, Chaetomtum, Cladosporium, Colletotrichum, Cunninghamella, Dothiorella, Geotrichum, Phoma y Phomopsis.

La Solicitud EP 13856 describe los efectos anti-fúngicos y anti-bacterianos de una combinación de 35 Propionibacterium jensenii con ciertas cepas de Lactobacillus casei subsp. paracasei.

Los inventores ahora han constatado que las bacterias de la cepa CNCM 1-1518 de la especie Lactobacillus casei subsp. paracasei poseían actividad anti-fúngica, en particular sobre mohos del género Penicillium, cuando se utilizan de forma aislada, es decir, sin estar asociadas a otras bacterias anti-fúngicas, y en particular con Propionibacterium

jensenii.

Esta actividad anti-fúngica tiene las siguientes características:

No se desarrolla cuando la cepa CNCM 1-1518 de L. casei se cultiva en medio sintético, pero aparece 45 cuando se cultiva en leche o en un medio a base de leche, a partir de 5 horas de cultivo. Alcanza su

máximo después de 24 a 48 horas de fermentación.

Es sensible al pH. Desaparece por debajo de pH 4, pero sin embargo vuelve a aparecer si el pH se eleva por encima de 4.

También es sensible al calor. Desaparece después de un tratamiento térmico de 1 minuto a 6 °C.

Por otra parte no está relacionada con la producción de ácidos orgánicos tales como ácido sórbico, ácido propiónico o ácido benzoico (que son conocidos por su actividad anti-fúngica), o de peróxido de hidrógeno, sustancias que no 55 son detectables en cultivos de la cepa CNCM 1-1518 dotados de propiedades anti-fúngicas.

La presente invención se refiere al uso de bacterias de la cepa CNCM 1-1518 de la especie L. casei subsp. paracasei para conferir propiedades anti-fúngicas a un producto lácteo fermentado.

En particular, la presente invención se refiere a un proceso para inhibir el desarrollo de un moho de la clase de los Ascomicetos, y especialmente del género Penicillium en un producto lácteo fermentado, caracterizado porque comprende la fermentación de un sustrato lácteo en presencia de una bacteria de la cepa CNCM 1-1518 durante un tiempo suficiente para la aparición en el sustrato de una actividad anti-fúngica. Esta actividad anti-fúngica tiene el 5 efecto de inhibir el desarrollo de dicho moho en caso de contaminación del producto por él después de la fermentación.

De manera ventajosa, la cantidad de dicha bacteria de la cepa CNCM 1-1518 usada para inocular el sustrato lácteo para dicha fermentación es de al menos 16, preferentemente de al menos 17, y de manera ventajosa entre 17 y 1 18 ufe por gramo de sustrato lácteo.

Según una aplicación preferida del proceso de acuerdo con la invención, la fermentación de dicho sustrato lácteo se lleva a cabo durante al menos 5 horas, preferentemente durante al menos 15 horas, y lo más preferentemente durante 24 a 48 horas. Para obtener una actividad anti-fúngica usando tiempos de fermentación cortos, es preferible 15 utilizar una cantidad relativamente grande de la cepa CNCM 1-1518; por ejemplo, para observar actividad anti- fúngica después de 5 horas de fermentación del sustrato lácteo, la siembra se lleva a cabo a una velocidad de al menos 17 ufe por gramo de sustrato lácteo.

De acuerdo con otro modo de aplicación preferida del proceso de acuerdo con la invención, comprende, si es 2 necesario, el ajuste del pH del sustrato fermentado a un valor superior a 4, preferentemente entre 4 y 6,5.

La cepa CNCM 1-1518 se describe en particular en la Solicitud EP79477; que fue presentada bajo las disposiciones del Tratado de Budapest el 3 de diciembre de 1994 en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos), 25 me du Docteur Roux, París.

La presente invención se entenderá mejor con la ayuda de la descripción adicional que sigue, que se refiere a ejemplos que ilustran la actividad anti-fúngica de la cepa CNCM 1-1518.

EJEMPLO 1: PUESTA EN EVIDENCIA DE LA ACTIVIDAD ANTI-FÚNGICA DE PRODUCTOS LÁCTEOS 3 FERMENTADOS EN PRESENCIA DE L. CASEISUBSP. PARACASEI.

Un producto lácteo fermentado que contiene L. casei subsp. paracasei (Actimel® que contiene la cepa CNCM 1-1518 asociada a S. thermophilus y L. bulgaricus), y un producto lácteo fermentado que contiene S. thermophilus y L. bulgarícus (control) se inocularon con 6 especies de hongos en una cantidad de 12 esporas: Mucor circinelloides (2 35 cepas ensayadas); Mucor plumbeus; Penicillium expansum; Penicillium roqueforti; Penicillium brevicompactum.

Estas especies son representativas de las contaminaciones que se encuentran habitualmente en los productos lácteos frescos.

Los productos se incubaron a continuación a 1 °C y se sometieron a ensayo cada 7 días para la aparición de tallos de crecimiento de hongos.

Se observa un desarrollo significativo de las especies de Mucor en ambos productos, a partir de 14 días en el caso de Actimel® y de 7 días para el producto de control. Sin embargo, se observa un crecimiento muy bajo (agregados) 45 o una ausencia de crecimiento visible de Penicillium en Actimel® después de 4 días de incubación, mientras que se observa una invasión de la superficie del producto de control en sólo 14 días.

En una segunda serie de experimentos, se evaluó la actividad anti-fúngica de la cepa CNCM 1-1518 mediante una técnica derivada de la de antibiogramas. Consiste en mezclar en agar el producto de ensayo (8% de producto + 5 2% de solución de agar a 15 g/l) y en verter la mezcla en una placa de Petri.

Sobre el medio solidificado se colocan 3 discos de papel estériles, sobre los que se depositan 1 esporas del moho a someter a ensayo (P. expansum. LMSA 83).

Las placas de Petri se incuban a 25 °C y 1 °C. El diámetro del tallo del hongo se mide periódicamente.

Los productos que fueron sometidos a ensayo son los siguientes: Actimel®; mezcla láctea de Actimel® con S. thermophilus y L bulgaricus, sin la cepa CNCM 1-1518; mezcla láctea de Actimel® sin S. thermophilus y L. bulgaricus, fermentado durante 24 horas en presencia de la cepa CNCM 1-1518.

Los resultados de dos ensayos para cada una de las condiciones sometidas a ensayo se ilustran en la Tabla I siguiente.

TABLA I