Uso de chaperonas moleculares para aumentar la producción de proteínas recombinantes secretadas en células de mamífero.

Una célula hospedadora CHO de mamífero para mejorar la expresión de una proteína bikunina recombinante,

teniendo dicha célula CHO de mamífero material genético que codifica para la expresión de dicha proteína bikunina recombinante y estando transformada con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Erp57.

Uso de chaperonas moleculares para aumentar la producción de proteínas recombinantes secretadas en células de mamífero Campo de la invención La presente invención se refiere al campo general de la producción de proteínas recombinantes en una célula hospedadora de mamífero. Específicamente, la presente invención se refiere a aumentar la producción de bikunina recombinante o proteína Factor VIII mediante la coexpresión de al menos una proteína chaperona Erp57 en la célula hospedadora de mamífero.

Antecedentes de la invención En las células procariotas y eucariotas, las proteínas chaperonas moleculares catalizan el intercambio de enlaces disulfuro y ayudan en el plegamiento correcto de proteínas recién sintetizadas. Esta observación ha conducido a una gran cantidad de estudios y se han propuesto usos para estas proteínas de control de calidad. Por ejemplo, el aumento de la actividad pDI (proteína disulfuro isomerasa) en sistemas de expresión de células bacterianas, de insecto y de levadura puede tener efectos beneficiosos sobre la solubilidad de la proteína y el plegamiento y, en algunos casos, puede conducir a un aumento de la secreción de proteínas heterólogas (1-7) . Además, otros estudios han mostrado que la chaperona molecular, proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina (BiP, también conocida como proteína regulada por glucosa) y la proteína de choque térmico 70 humana (Hsp 70) , tienen un efecto beneficioso sobre la expresión de proteínas recombinantes en sistemas de células de insectos (5, 8-12) .

Las chaperonas moleculares no han tenido el mismo nivel de éxito sobre la expresión y la secreción de proteínas recombinantes en sistemas de células de mamífero. Por ejemplo, la hiperexpresión de la chaperona pDI en células de ovario de hámster chino (CHO) no solo no tuvo efecto sobre los niveles de secreción de IL-15, sino que además causó una disminución en la secreción, y un aumento de la retención celular de una proteína de fusión receptor de factor de necrosis tumoral-Fc (TNFR: Fc) (13) . Otros estudios han mostrado que la hiperexpresión de la chaperona BiP en células de mamífero puede conducir a una mayor retención celular y a una disminución de la secreción de proteínas recombinantes (14-15 y el documento de Patente de EE.UU. nº 4.912.040) . Los mecanismos reguladores implicados en el procesamiento de proteínas dentro de la célula de mamífero son complejos y probablemente implican la cooperación de muchas de estas proteínas chaperonas. Por lo tanto, no se puede predecir si una chaperona particular producirá un aumento de la producción de una determinada proteína recombinante.

Debido a las teorías contradictorias en este tema, el efecto de las proteínas chaperonas sobre la producción de un producto proteico recombinante secretado no se entiende ni se aprecia. El documento de Patente de EE.UU. nº

6.451.597 (la patente 597) describe un método para mejorar la producción de partículas víricas, y especula sobre el efecto de las chaperonas en la mejora del rendimiento de una proteína recombinante en células eucariotas. Sin embargo, no se describe ninguna expresión real de una proteína recombinante. Sin embargo, otros estudios han encontrado que la hiperexpresión de chaperonas en líneas de células eucariotas o bien no tuvo efecto sobre los rendimientos del producto o había una reducción de la secreción de las proteínas recombinantes (14, 15) . Véase también el documento de Patente de EE.UU. nº 4.912.040. Teniendo en cuenta las teorías contradictorias en este tema, la patente 597 no permite que un experto en la técnica utilice chaperonas para mejorar la producción y la secreción de una proteína recombinante en células eucariotas. El estado de la técnica no explica cómo predecir qué efecto va a tener una chaperona particular sobre la producción y la secreción de una proteína recombinante dada en modelos de cultivos celulares, tales como los descritos en el presente documento. Los solicitantes se sorprendieron en consecuencia, por encontrar que cuando las chaperonas descritas en este estudio se transfectaban en líneas celulares de mamífero que expresaban una proteína recombinante secretada, el efecto resultante era un aumento general en la producción de la proteína secretada.

Compendio de la invención En un primer aspecto de la invención, se proporciona una célula hospedadora CHO de mamífero para mejorar la expresión de una proteína bikunina recombinante, teniendo dicha célula CHO de mamífero un material genético que codifica para la expresión de dicha proteína bikunina recombinante y estando transformada con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Erp57.

En una realización del primer aspecto de la invención, el producto proteico recombinante se secreta.

En otra realización de la invención, el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

En otra realización de la invención, la célula hospedadora de mamífero se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una célula hospedadora CHO de mamífero para mejorar la expresión de una proteína bikunina recombinante, en donde el método comprende proporcionar una

célula CHO de mamífero que tiene material genético que codifica para la expresión de una proteína bikunina recombinante; y transformar la célula CHO de mamífero con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Erp57.

En una realización de este aspecto de la invención, el producto proteico recombinante se secreta.

En otra realización de la invención, el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

En otra realización de la invención, la célula hospedadora de mamífero se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un producto proteico recombinante secretado, en donde el método comprende las etapas de: cultivar una célula hospedadora de mamífero de la reivindicación 1 o la reivindicación 2; y recuperar a partir del medio de cultivo la proteína recombinante así producida y secretada de esta manera.

En una realización de este aspecto de la invención, el producto proteico recombinante es secretado.

En otra realización de la invención, el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

En otra realización de la invención, la célula hospedadora de mamífero se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento de una proteína bikunina recombinante en donde el material genético que codifica para la expresión de dicha proteína recombinante se ha introducido previamente en la línea celular para formar la primera línea celular, comprendiendo dicho método las etapas de: insertar al menos un vector de expresión de la proteína chaperona que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Erp57 en dicha primera línea celular para formar de este modo una línea celular modificada; y seleccionar a partir de dicha línea celular modificada al menos una segunda línea celular que muestra un rendimiento mejorado de la proteína recombinante.

En una realización de este aspecto de la invención, el producto proteico recombinante es secretado.

En otra realización de la invención, el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la primera línea celular.

En otra realización de la invención, la segunda línea celular se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

En otra realización de la invención, se produce al menos una segunda línea celular a partir de dicha primera línea celular seleccionando una porción de dicha primera línea celular que muestra integración del vector de expresión de la proteína chaperona dentro del ADN del hospedador.

También se describe un método para mejorar el rendimiento de una proteína recombinante o de un fragmento de la misma en una... [Seguir leyendo]

1. Una célula hospedadora CHO de mamífero para mejorar la expresión de una proteína bikunina recombinante, teniendo dicha célula CHO de mamífero material genético que codifica para la expresión de dicha proteína bikunina recombinante y estando transformada con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Erp57.

2. Una célula hospedadora BHK de mamífero para mejorar la expresión de una proteína del Factor VIII recombinante, teniendo dicha célula BHK de mamífero material genético que codifica para la expresión de dicho Factor VIII recombinante y estando transformada con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Erp57 y al menos un vector de expresión que comprende calreticulina.

3. La célula hospedadora de mamífero según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la proteína recombinante es secretada.

4. La célula hospedadora de mamífero según la reivindicación 3, en la que el material genético que codifica para la expresión de dicha proteína recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

5. La célula hospedadora de mamífero según la reivindicación 4, transformada adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

6. Un método para producir una célula hospedadora CHO de mamífero según la reivindicación 1, en donde el método comprende:

proporcionar una célula CHO de mamífero que tiene material genético que codifica para la expresión de una proteína bikunina recombinante; y

transformar la célula CHO de mamífero con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Erp57.

7. Un método para producir una célula hospedadora BHK de mamífero según la reivindicación 2, en donde el método comprende:

proporcionar una célula BHK de mamífero que tiene material genético que codifica para la expresión de una proteína del Factor VIII recombinante; y

transformar la célula de mamífero con al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína chaperona Erp57 y al menos un vector de expresión que comprende ADN que codifica la proteína chaperona calreticulina.

8. El método según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el producto proteico recombinante es secretado.

9. El método según la reivindicación 8, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicho producto proteico recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

10. El método según una la reivindicación 6 o la reivindicación 7, transformado adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

11. Un método para producir un producto proteico recombinante secretado que comprende las etapas de:

cultivar una célula hospedadora de mamífero según la reivindicación 1 o la reivindicación 2; y

recuperar a partir del medio de cultivo la proteína recombinante producida y secretada de este modo.

12. El método según la reivindicación 11, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicha proteína recombinante está integrado en el ADN de la célula hospedadora.

13. El método según la reivindicación 11, en el que dicha célula hospedadora de mamífero se transforma adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

14. Un método para mejorar el rendimiento de proteína bikunina recombinante, en el que el material genético que codifica para la expresión de dicha proteína recombinante se ha introducido previamente en la línea celular para formar la primera línea celular, comprendiendo dicho método las etapas de:

insertar al menos un vector de expresión de proteína chaperona que comprende ADN que codifica la proteína chaperona Erp57 en dicha primera línea celular para formar de este modo una línea celular modificada; y

seleccionar a partir de dicha línea celular modificada al menos una segunda línea celular que muestra un mayor rendimiento de la proteína recombinante.

15. Un método para mejorar el rendimiento de proteína del Factor VIII recombinante, en donde el material genético que codifica para la expresión de dicha proteína recombinante se ha introducido previamente en una línea celular BHK para formar una primera línea celular, comprendiendo dicho método las etapas de:

insertar al menos un vector de expresión de la proteína chaperona que comprende ADN que codifica la proteína 5 chaperona Erp57 y ADN que codifica la proteína chaperona CRT en dicha primera línea celular de modo que se forma una línea celular modificada; y

seleccionar a partir de dicha línea celular modificada al menos una segunda línea celular que muestra un mayor rendimiento de la proteína recombinante.

16. El método según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que el material genético que codifica para la 10 expresión de dicha proteína recombinante está integrado en el ADN de la primera línea celular.

17. El método según la reivindicación 16, en el que la segunda línea celular se transfecta adicionalmente con un vector de expresión que comprende ADN que codifica una proteína sintetasa de glutamina.

18. El método según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que se produce al menos una segunda línea

celular a partir de dicha primera línea celular mediante la selección de una porción de dicha primera línea celular que 15 muestra la integración del vector de expresión de la proteína chaperona en el ADN del hospedador.