TRIPLE MUTANTE DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS erp-, phoP- y DIM-.

Triple mutante del complejo Mycobacterium tuberculosis erp-, phoP- y DIM-.

La presente invención se refiere a un microorganismo aislado del complejo Mycobacterium tuberculosis que comprende la inactivación o deleción del gen erp, del gen phoP y de un gen que previene la producción de dimicocerosatos de tiocerol (DIM). Dicho microorganismo es útil para el tratamiento o prevención de la tuberculosis, para el tratamiento del cáncer de vejiga y como vector o adyuvante. Además, también se refiere a la composición farmacéutica que lo comprende y a su uso como vacuna, vector o adyuvante; así como al método de producción de dicho microorganismo.

La presente invención se refiere a un microorganismo aislado del complejo Mycobacterium tuberculosis que comprende la inactivación o deleción de del gen erp, del gen phoP y de un gen que previene la producción de dimicocerosatos de tiocerol (DIM) . Dicho microorganismo es útil para el tratamiento o prevención de la tuberculosis, para el tratamiento del cáncer de vejiga y como vector o adyuvante. Por lo tanto, la presente invención se podría encuadrar en el campo de la medicina.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La tuberculosis (TB) se mantiene como uno de los problemas de salud pública global más importantes y Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la TB humana, infecta un tercio de la población mundial. En 2011 8, 7 millones de nuevos casos fueron detectados y 1, 4 millones de personas murieron a causa de la enfermedad. Con la TB causando un cuarto de las muertes provocadas en pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la emergencia causada por el incremento de las cepas de M. tuberculosis resistentes a fármacos, una vacuna efectiva es más necesaria que nunca para reducir el peso de la enfermedad (Glaziou P, et al. Semin Respir Crit Care Med 2013 Feb;34 (1) :3-16)

La vacuna actual usada contra la tuberculosis, Mycobacterium bovis Bacille-Calmette Guerin (BCG) , ha sido administrada desde 1921 confiriendo protección contra las formas más severas de la enfermedad (meningitis tuberculosa y tuberculosis miliar) en niños pero pierde efectividad protegiendo contra la forma pulmonar de la enfermedad, la forma más común de transmisión (WHO. Information Sheet: observed rate of vaccine reactions Bacille Calmette-Ghérin (BCG) vaccine. Global Vaccine Safety, Immunization and Biologicals 2012 April 2012) . Aunque BCG es considerada como una vacuna muy segura y es administrada de forma global, estados de inmunodeficiencia severa han sido relacionados con un incremento del riesgo de una diseminación en el sistema de BCG post-vacunación (Murphy D, et al. Tuberculosis (Edinb) 2008 88 (4) :344-57) . Aquellos grupos de riesgo para los que la vacunación con BCG está contraindicada incluyen pacientes con inmunodeficiencias, tanto primarias como secundarias y personas infectadas con el virus VIH, incluidos neonatos (WHO.

Information Sheet: observed rate of vaccine reactions Bacille Calmette-Ghérin (BCG) vaccine. Global Vaccine Safety, Immunization and Biologicals. 2012 April 2012) . Ha habido una especial preocupación acerca de la implicación del VIH en la seguridad de la vacunación con BCG (Mak TK, et al. Lancet 2008 Sep 6;372 (9641) :786-7) . Una reciente retrospectiva ha documentado una alta frecuencia de infecciones de BCG en niños infectados con VIH (Hesseling AC, et al. Vaccine 2007 Jan 2;25 (1) :14-8) . La política actual de vacunación de la Organización Mundial de la Salud recomienda la no vacunación con BCG en niños que se sabe infectados de VIH, con o sin síntomas manifestados.

Una de la ventajas del uso de vacunas vivas atenuadas basadas en aislamientos clínicos de M. tuberculosis es que mantienen la mayoría de los antígenos ausentes en M. bovis y otros que BCG perdió durante el proceso de los cultivos sucesivos (Arbues A, et al. Vaccine 2013 31 (42) :4867-73; Brosch R, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2007 104 (13) :5596-601) , por ello representan una alternativa racional para reemplazar a BCG. Además, el uso de BCG está contraindicado en pacientes con inmunodeficiencias, tanto primarias como secundarias, incluyendo aquellos infectados con VIH (WHO. Information Sheet: observed rate of vaccine reactions Bacille Calmette-Ghérin (BCG) vaccine. Global Vaccine Safety, Immunization and Biologicals. 2012 April 2012) . El desarrollo de nuevas vacunas más seguras que BCG que puedan ser usadas en esta población es necesario.

El principal reto en el desarrollo de vacunas vivas es conseguir un grado satisfactorio de atenuación y seguridad manteniendo la inmunogenicidad y la protección de la vacuna. Hay ejemplos en la literatura de mutantes vivos atenuados de M. tuberculosis como candidatos a vacuna que aunque atenuados, confieren protección contra la enfermedad similar a BCG. Por ejemplo, se ha descrito un mutante simpe auxótrofo de M. tuberculosis deficiente en la biosíntesis de leucina (¨leu) presenta atenuación in vitro e in vivo pero se caracteriza por una baja eficacia protectora comparado con BCG (Hondalus MK, et al. Infect Immun 2000 68 (5) :2888-98) .

La vacuna denominada MTBVAC, es una vacuna viva de M. tuberculosis basada en deleciones en los genes phoP y fadD26 y es la primera vacuna que cumple con el criterio de Ginebra (Kamath AT, et al. Vaccine 2005 23 (29) :3753-61) . MTBVAC confiere mayor protección que BCG en modelo de ratón y tiene un perfil de seguridad

similar (Arbues A, et al. Vaccine 2013 31 (42) :4867-73) . MTBVAC es la primera vacuna basada en M. tuberculosis atenuada que ha entrado en ensayos clínicos (identificador del ensayo clínico en ClinicalTrials.gov: NCT02013245) . Sin embargo, MTBVAC no está recomendada para su uso en pacientes con riesgo de inmunosupresión.

Durante la pasada década numerosos esfuerzos fueron puestos en la construcción de nuevas vacunas contra la tuberculosis, incluyendo vacunas capaces de ser usadas en pacientes inmunodeprimidos (Marinova D, et al. Vaccines 2013 Dec:12 (12) :1431-48) . Para ello se has usado diferentes aproximaciones, incluyendo cepas de BCG recombinantes, administración de potenciadores después de la vacunación con BCG

o cepas vivas atenuadas de M. tuberculosis, todas ellas están en diferentes fases de ensayos clínicos o preclínicos. Sin embargo, se hace necesaria una vacuna que sea lo suficientemente efectiva y esté lo suficientemente atenuada para poder ser utilizada en pacientes con riesgo de inmunosupresión, incluso en recién nacidos con riesgo de inmunosupresión.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante perteneciente al complejo M. tuberculosis que comprende la inactivación o deleción del gen erp, del gen phoP y de un gen que previene la producción de dimicocerosatos de tiocerol

(pthicerol dimycocerosates, DIM) . Las tres mutaciones presentan un efecto sinérgico en su extremada atenuación, el triple mutante está sorprendentemente altamente atenuado y mantiene la capacidad de protección contra la tuberculosis. Por lo tanto, es útil en todos los pacientes, incluso en pacientes con riesgo de inmunosupresión.

En la presente invención se ha realizado la triple mutación en M. tuberculosis y los resultados son extrapolables a los demás miembros del complejo M. tuberculosis. El experto en la materia conoce que los miembros del complejo M. tuberculosis, entre los que se encuentran M. tuberculosis (principal agente causante de tuberculosis en humanos) , M. bovis (responsable de TB en bovinos y que incluye la cepa BCG) , M. africanum (el principal causante de TB en África) , M. microti, M. caprae, M. pinnipedii,

y M. canetti representan una única especie debido a las similitudes entre ellos (Cole ST, et al. Nature 1998 393: 537-544; Imaeda T, International Journal of Systematic

Bacteriology 1985 35 (2) :147-150; Van Soolingen D, et al. International Journal of Systematic Bacteriology 199747 (4) :1236-1245; Brosch R, et al. PNAS 2002 99 (6) :3684–3689) . Por otra parte, como bien conoce el experto en la materia, entre los distintos miembros del complejo M. tuberculosis, es conocida la existencia del gen phoP, de varios genes que producen DIM (entre ellos el gen fadD26) y del gen erp (Berthet FX, et al. Science 1998 Oct 23;282 (5389) :759-62; Bigi F, et al. Tuberculosis (Edinb) 2005 Jul;85 (4) :221-6) y también de la gran similaridad entre ellos (Zahrt TC y Deretic V, PNAS 2001 98 (22) :12706-12711; Soto CY, et al. J Clin Microbiol 2004 42 (1) :212-219; Camacho LR, et al. Mol Microbiol 1999 34 (2) :257-267, Camacho LR, et al. J Biol Chem 2001 276 (23) :19845-19854; Cox JS, et al. Nature 1999 402:79-83) .

La presente invención también se refiere al uso del microorganismo de la invención y de la composición farmacéutica que la comprende para las mismas indicaciones que el experto en la materia conoce para la vacuna BCG. Por lo tanto, el microorganismo de la invención y la composición farmacéutica de la invención se pueden utilizar para el tratamiento o prevención de tuberculosis, para el tratamiento frente al cáncer de vejiga (Lamm DL, et al. The Journal of Urology 2000; 163:1124-1129; Saint F, et al. European Urology 2003; 43:351-361) , y como adyuvante o vector (Stover CK, et al. Nature 1991; 351 (6) :456-460 y Bastos RG, et al. Vaccine 2009; 27:6495-6503) .

Por lo tanto, un primer aspecto, la presente invención se refiere a un microorganismo... [Seguir leyendo]

1. Microorganismo aislado perteneciente al complejo Mycobacterium tuberculosis que comprende la inactivación o deleción de: 5 a. el gen erp,

b. el gen phoP y

c. un gen que previene la producción de dimicocerosatos de tiocerol (DIM) .

2. Microorganismo aislado según la reivindicación 1 donde el gen que previene la 10 producción de DIM es el gen fadD26.

3. Microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde microorganismo aislado se selecciona de la lista que comprende M. tuberculosis,

M. bovis, M. africanum, M. caprae, M. pinnipedii, M. canetti y M. microti. 15

4. Microorganismo aislado según la reivindicación 3 donde el microorganismo es M. tuberculosis.

5. Uso del microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 20 para la elaboración de una composición farmacéutica.

6. Uso según la reivindicación 5 donde la composición farmacéutica es una vacuna.

7. Uso del microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4

para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de tuberculosis.

8. Uso del microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4

para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de 30 cáncer de vejiga.

9. Uso del microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como vector o adyuvante.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en un individuo con riesgo de inmunosupresión.

11. Uso según la reivindicación 10 donde el individuo es portador del virus de la inmunodeficiencia humana.

12. Composición farmacéutica que comprende el microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12 que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. 10

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13 que además comprende un adyuvante.

15. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 en el

que la composición farmacéutica está en una forma farmacéutica adecuada para su administración por vía transdérmica, parenteral, intranasal, respiratoria, perioral, sublingual, oral o tópica.

16. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 donde 20 la composición está en forma liofilizada, sólida o líquida.

17. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 para estimular y/o inducir la respuesta inmune en un sujeto.

18. Uso según la reivindicación 17 como vacuna.

19. Uso según la reivindicación 17 como vector o adyuvante.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 para el tratamiento o 30 prevención de tuberculosis.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 para el tratamiento de cáncer de vejiga.

22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 en un individuo con riesgo de inmunosupresión.

23. Uso según la reivindicación 22 donde el individuo es portador el virus de la inmunodeficiencia humana.

24. Método para construir el microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende la inactivación o deleción de:

a. el gen erp,

b. el gen phoP y

c. un gen que previene la producción de DIM. 10

25. Método según la reivindicación 24 donde el gen que previene la producción de DIM es el gen fadD26.

26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 o 25 donde microorganismo

aislado se selecciona de la lista que comprende M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. caprae, M. pinnipedii, M. canetti y M. microti.

27. Método según la reivindicación 26 donde el microorganismo es M. tuberculosis.

FIG. 1A

FIG. 1B

FIG. 1C

FIG. 2A

FIG. 2B

FIG. 3A

FIG. 3B

FIG. 4A

BazoCD4+/IFNͲɶ

*

FIG. 4B

BazoCD8+/IFNͲɶ

FIG. 4C

PulmónCD4+/IFNͲɶ

%células

FIG. 4D

PulmónCD8+/IFNͲɶ

0, 4

%células

0, 3

0, 2 0, 1

0, 0

LISTADO DE SECUENCIAS

lt;110gt; Universidad de Zaragoza

lt;120gt; Triple mutante del complejo Mycobacterium tuberculosis erp-,

phoP- y DIM

lt;130gt; ES1510.109

lt;160gt; 4

lt;170gt; PatentIn version 3.5

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lt;211gt; 26

lt;212gt; DNA

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador sentido erpF

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agcgggccct cgatgcggtg gtcagc 26

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lt;212gt; DNA

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador antisentido erpRV

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aaggggccca tactcggtct gataccacgg 30

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lt;213gt; Secuencia artificial

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lt;223gt; Cebador erpMUT1

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acgtcgagat cgttgtagtt catcac 26

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lt;223gt; Cebador erpMUT2

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ccaagttcca cggacccgt 19