Soporte ópticamente transparente para la obtención de especímenes de tipo fluido libres de burbujas.

Soporte ópticamente transparente para la obtención de especímenes de tipo fluido libres de burbujas.

Soporte ópticamente transparente para especímenes de tipo fluido, que comprende dos sustratos transparentes enfrentados entre sí, uno denominado portaobjetos (2) y otro denominado cubreobjetos (8), en el que al menos uno de los sustratos está provisto de una superficie hidrófoba enfrentada al otro sustrato cuyo ángulo de contacto con el agua de al menos 90º. El soporte hace posible la obtención de especímenes de tipo fluido libres de burbujas.

Soporte ópticamente transparente para la obtención de especímenes de tipo fluido libres de burbujas

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con soportes para especímenes. En particular, se trata de un soporte para evitar burbujas de aire en especímenes fluidos que garantiza la ausencia de burbujas de aire o una cantidad reducida de burbujas de aire en cualquier muestra que contiene al menos un fluido depositado sobre el sustrato.

Técnica anterior

El problema de las burbujas de aire en la formación de imágenes ópticas (microscopía)

La preparación y el traslado de especímenes sobre portaobjetos transparentes a menudo es crítica para una inspección exitosa de los mismos usando un sistema de formación de imágenes. La preparación de portaobjetos ha recibido mucha atención desde la invención del microscopio, siendo un área muy desarrollada, que a menudo se basa en muchas técnicas especializadas y bastante sofisticadas.

En una preparación seca (preparación microscópica), que es la forma más simple de preparación, la muestra se sitúa, en primer lugar, sobre el portaobjetos transparente. Se puede colocar un cubreobjetos sobre la parte superior para proteger el espécimen y el objetivo del microscopio y para mantener el espécimen en reposo y plano. Se puede usar con éxito este tipo de preparación para inspeccionar especímenes como polen, plumas, pelos, etc. También se usa para examinar partículas atrapadas en filtros de membranas transparentes (por ejemplo, en el análisis de polvo en suspensión).

En una preparación húmeda o temporal (preparación microscópica), se coloca el espécimen en una gota de agua o u otro líquido mantenido entre el portaobjetos y el cubreobjetos por tensión superficial. Este procedimiento se usa comúnmente, por ejemplo, para observar organismos microscópicos que crecen en agua de estanque u otros medios líquidos, en especial cuando se estudia su movimiento y su comportamiento. Se requiere especial atención para excluir burbujas de aire, que podrían interferir con la visión así como dificultar

los movimientos de los organismos. También se usa para investigaciones rápidas en las que no se requiere un registro permanente, así como para examinar líquidos fisiológicos como sangre, orina, saliva, semen (en espermiograma), y flujo vaginal (preparación microscópica húmeda vaginal).

En una preparación microscópica preparada o permanente para análisis patológico o biológico, normalmente el espécimen se somete a una preparación histológica compleja que puede implicar cortarlo en secciones muy finas con un microtomo, fijarlo para evitar su descomposición, retirar cualquier contenido de agua, teñir partes específicas, aclarar para volverlo transparente, e impregnarlo o infiltrarlo con alguna sustancia sólida transparente. Como parte de este procedimiento, normalmente el espécimen se une firmemente al portaobjetos.

Así, sin contenido en agua, en las preparaciones microscópicas permanentes no existe problema de burbujas de aire en su interior, mientras que sí que son frecuentes cuando se usan preparaciones microscópicas húmedas (temporales).

En una preparación microscópica húmeda, el espécimen está en una gota de líquido (normalmente agua) situado entre el portaobjetos y el cubreobjetos de vidrio. En índice de refracción del agua mejora la calidad de la imagen y también soporta el espécimen. Al contrario que los portaobjetos montados de forma permanente, las preparaciones microscópicas húmedas no se pueden almacenar durante periodos de tiempo extensos, ya que el agua se evapora. Por este motivo, a veces una preparación microscópica húmeda se denomina "preparación microscópica temporal" al contrario que las "preparaciones microscópicas permanentes", que se pueden almacenar durante periodos más largos. Los portaobjetos montados de forma permanente usan un medio de montura de solidificación que mantiene el cubreobjetos de vidrio en su sitio.

Una preparación de la muestra con poco cuidado puede generar burbujas de aire en la preparación microscópica y a menudo, esto implica la repetición de la preparación. Las burbujas de aire tienen índices de refracción diferentes al medio circundante, por ejemplo, agua. En una foto tomada usando un sistema de formación de imágenes, el efecto de la diferencia del índice de refracción produce un borde grueso negro alrededor de las burbujas. La forma esférica de las burbujas centra la luz de tal forma que el centro de la burbuja aparece brillante.

El material y la geometría del espécimen pueden afectar a la formación de burbujas de aire. Algunos especímenes producen más burbujas de aire que otros y esto depende de una amplia variedad de factores. Por ejemplo, los especímenes porosos, por ejemplo, células madre vegetales o tejido vascular, se pueden llenar de aire, que es difícil de retirar. La retirada de aire se puede realizar colocando el espécimen en una cámara a vacío mientras se sumerge en la solución de fijación. Este procedimiento requiere un equipo y preparación de muestra adicionales, prolongando así el tiempo de análisis e incrementando los costes.

Es cierto que para el análisis se pueden tolerar algunas burbujas de aire y, a menos que se requiera formación de imágenes de alta resolución, el esfuerzo para preparar un espécimen completamente libre de estas burbujas puede que no sea necesario. En algunos casos, existen formas prácticas sencillas de evitar el problema, tales como mover el portaobjetos con respecto al punto de imagen y observar un área del espécimen diferente y libre de burbujas. Sin embargo, en general, se deben evitar las burbujas de aire, en especial para operadores no altamente cualificados, que las pueden confundir con las características reales de un espécimen. Existen varias razones por las que las burbujas de aire pueden ser problemáticas, que incluyen:

Las burbujas impiden el movimiento libre de organismos, tales como ciliados.

Las burbujas provocan artefactos ópticos en la interfase entre aire y agua. Las burbuja de aire parece que están rodeadas por un anillo oscuro que oculta algunas partes del espécimen.

La óptica de microscopía está diseñada para una resolución óptima para un espécimen rodeado por agua u otros líquidos. Si la burbuja es tan grande que el espécimen esté completamente rodeado por aire, entonces la resolución disminuye drásticamente.

La gran variedad en forma y tamaño de las burbujas de aire hace de la lectura una interpretación del espécimen aún más difícil.

Medidas prácticas para minimizar las burbujas en preparaciones microscópicas para portaobjetos

Colocación de cubreobjetos: El cubreobjetos se coloca sobre la gota de agua con un ángulo. Usando este procedimiento, se deja escapar el aire a través de un lado.

Colocación de agua: Si el espécimen no está totalmente sumergido en la gota de agua, se debe añadir otra gota en la parte superior del espécimen antes de colocar el

cubreobjetos.

Aceite de inmersión: Se puede usar un medio líquido diferente de agua, por ejemplo aceite de inmersión, que es hidrófobo.

Rotura de la tensión superficial: La adición de una pequeña cantidad de detergente, tal como jabón, rompe la tensión de superficie del agua. Debido a esto, el agua se adhiere mejor a algunos especímenes, evitando así las burbujas. Sin embargo, el jabón puede dañar algunos organismos acuáticos.

Vacío: Se puede usar para facilitar y acelerar el movimiento de la solución de fijación o del agua en el espécimen.

Deshidratación del espécimen: Algunos especímenes colocados en alcohol se encogerán y perderán agua y aire. Al colocar el espécimen de nuevo en agua, el espécimen la absorberá.

Retirada de aceite y grasas: Se lava el espécimen en alcohol.

Adición de agua: Si la burbuja de aire es grande y alcanza el borde del cubreobjetos, se puede añadir más agua desde el borde del cubreobjetos.

Existe una clara necesidad de evitar las burbujas en la preparación de muestras biológicas o más en general, muestras de sistemas de formación de imágenes. Aunque se pueden tomar algunas precauciones para minimizar la formación de burbujas de aire sobre los portaobjetos, aún no existe una solución para evitarlas completamente o para reducirlas hasta un nivel aceptable de manera repetible y económica.

Concepto "libre de burbujas"

El término "libre de burbujas" tiene un significado que varía dependiendo de la aplicación. Sin embargo, en general, se usa para querer decir que las burbujas no son visibles a simple vista y que el residuo de burbujas, espacios vacíos o cráteres, tampoco es...

1. Soporte ópticamente transparente para especímenes de tipo fluido, que comprende dos sustratos transparentes enfrentados entre sí, uno denominado portaobjetos (2) y otro

denominado cubreobjetos (8), en el que al menos uno de los sustratos está provisto de una superficie hidrófoba enfrentada al otro sustrato.

2. Soporte ópticamente transparente según la reivindicación 1, en el que dicha superficie hidrófoba es una superficie nanoestructurada (4).

3. Soporte ópticamente transparente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los sustratos son biocompatibles.

4. Soporte ópticamente transparente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, 15 que comprende un espaciador (9) entre los dos sustratos transparentes para formar una

cámara con una distancia específica entre el portaobjetos (2) y el cubreobjetos (8).

5. Soporte ópticamente transparente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos la superficie superior del portaobjetos (2) es hidrófoba.