Sonda de ácido nucleico peptídico, estuche y método para la detección y/o cuantificación de Salmonella spp. y sus aplicaciones.

Sonda de PNA para la detección y/o cuantificación de Salmonella, caracterizada por que comprende SEQ ID No. 1 - 5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3'.

Sonda de ácido nucleico peptídico, estuche y método para la detección y/o cuantificación de SaZmoneZZa spp.y sus aplicaciones.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para la detección de microorganismos importante para la seguridad clínica y alimentaria. Con este propósito, se desarrolló una sonda de PNA para la detección del género SaZmoneZZa.

Además de la sonda, la presente Invención Incluye el procedimiento de FISH de PNA y su aplicación a un estuche para la detección yZo la cuantificación de Sa/moneZZa spp., que se puede usar en los campos alimentario y clínico.

Antecedentes de la invención

El género Sa/mone/Za Incluye varias bacterias patógenas que pueden provocar enfermedades que varían de una simple gastroenteritis a Infecciones slstémlcas. La gravedad de la enfermedad generalmente está determinada por la virulencia de la especleZcepa de Sa/mone/Za, el huésped (ser humano u otra especie de animal) y el estado de salud del huésped.

Los análisis fllogenétlcos del género han mostrado que se divide en dos especies: SaZmoneZZa óongon y SaZmoneZZa enferZca. Sin embargo, se han identificado hasta la fecha más de 2.500 serotipos, la mayoría de los cuales capaces de Infectar a seres humanos y una amplia gama de especies de animales. Las cepas de SaZmoneZZa se identifican y clasifican convencionalmente según el esquema de serotlpaje de Kauffmann-White, que se basa en el tipo de antígenos que están presentes en la membrana exteARN.

Esta bacteria se puede transmitir directamente de persona a persona a través de la ruta fecal-bucal o mediante contacto directo con reservónos externos cuando se produce contaminación fecal de suelo, agua y alimentos. Por lo tanto, es Importante desarrollar un método de detección consistente que permita la identificación de la bacteria en todos estos tipos de muestra. Por ejemplo, la "Food and drug Administraron" trata de combatir la transmisión de Sa/mone/Za enferífídís a través de la puesta en práctica de un programa de prueba en granjas avícolas para cáscaras de huevo contaminadas, puesto que las cáscaras de huevo se han identificado como importantes en la transmisión del microorganismo.

La detección de Sa/moneZZa se realiza tradicionalmente usando métodos de cultivo. Sin embargo, estos métodos son procedimientos laboriosos y que consumen bastante tiempo (de 4 a 6 días) y trabajo. Como tales, se necesita el desarrollo de nuevos métodos, que sean más rápidos y más fiables, que puedan ayudar en el control de las bacterias a fin de reducir la salmonelosis tanto en personas como en animales. Con este propósito, se ha desarrollado un número de métodos de detección molecular para reducir el tiempo requerido para la identificación de SaZmoneZZa en alimentos, heces, agua y muestras clínicas. Estos métodos incluyen ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y FISH. Sin embargo, algunos estudios mostraban que los métodos basados en PCR y ELISA no detectaban algunas muestras que eran positivas mediante un método de cultivo. Aún así, los métodos basados en PCR han resultado ser más exactos que los métodos basados en ELISA. Por otra parte, cuando se realiza una etapa de enriquecimiento selectivo antes de la PCR, no solo se detectan todas las muestras positivas al cultivo, sino que también la presencia de SaZmoneZZa que no se detectaba mediante el método de cultivo se puede detectar mediante PCR. Estos estudios revelan que la etapa de enriquecimiento puede incrementar la sensibilidad del ensayo molecular eliminando problemas tales como los bajos números de bacterias y la presencia de sustancias inhibidoras en ciertos tipos de muestras, tales como muestras alimentarias y fecales. Sin embargo, los métodos basados en PCR requieren habitualmente una etapa de extracción de ADN, y ninguno de los métodos mencionados anteriormente, excepto FISH, permite una visualización directa de la bacteria dentro de la muestra. Esto puede ser importante, por ejemplo, al permitir la evaluación de contaminación por SaZmoneZZa en cáscaras de huevo directamente en la muestra.

FISH es un ensayo molecular ampliamente aplicado para la identificación y localización bacterianas dentro de muestras. Este método se basa en la unión específica de pequeños oligonucleótidos (sondas) a regiones de rARN particulares. La sonda se acopla a un fluorocromo y después de la hibridación se puede detectar una señal de fluorescencia debido al alto número de copias de rARN dentro de la célula. Ya existen algunos estudios que presentan la detección de SaZmoneZZa usando sondas de ADN (Kutter y cois., 2006; Nordentoft y cois., 1997).

Más recientemente, se han desarrollado sondas de ácido nucleico peptídico (PNA) para la detección microbiana. Estas moléculas son miméticas del ADN y son capaces de hibridarse específicamente con ácidos nucleicos complementarios obedeciendo a las reglas de Watson-Crick. Sin embargo, el enlace establecido es más fuerte ya que, en la molécula de PNA, su estructura de esqueleto de fosfato de azúcar cargada negativamente se sustituye por unidades de (2-aminoetil)gl¡c¡na neutras repetidas. El uso adecuado de esta molécula en la tecnología FISH ha

hecho al procedimiento más consistente, más rápido y más eficaz.

Para la SaZmoneZZa, previamente se ha desarrollado un método de FISH de PNA (Perry-O'Keefe y cois., 2001). Sin embargo, la sonda que se usaba tiene una secuencia que es complementaria con otras especies, tales como AcfZnoóacZ/Zus acf/nomycefemcom/fans, Bucanera apZr/d/coZa, FZaemopZrZZus Zn/Zuenza y Yers/n/a spp., haciéndola menos atractiva para el diagnóstico. Así, se consideraba importante diseñar y probar una nueva sonda y desarrollar un nuevo método para este microorganismo particular.

Es importante apuntar que, aunque muy consistentes después de optimizados, el desarrollo de métodos de FISH de PNA es, igual que el desarrollo de métodos de PCR, extremadamente exigente y requiere un gran conocimiento de las características químicas y físicas de los diferentes parámetros implicados. Por otra parte, se sabe bien que tener un método de FISH de PNA que trabaje para un organismo no garantiza que funcionen otras secuencias que tienen como diana el mismo organismo. Además, aunque los investigadores habitualmente sienten una natural falta de interés por la publicación de resultados negativos, se pueden encontrar en la bibliografía varios estudios en los que los autores solo eran capaces de hacer trabajar algunas de las sondas para el mismo microorganismo.

Compendio de la Invención

La presente invención se refiere a una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA) y a un método de la misma para la detección del género SaZmoneZZa (esto es, identificación o cuantificación).

La sonda descrita en la presente invención reconoce el rARN del microorganismo 23S o las secuencias genómicas correspondientes al mencionado rARN. Las sondas de PNA tienen características fisicoquímicas que son inherentes a su estructura y, cuando se aplican a un método basado en FISH, permiten un análisis más rápido, más consistente

y más específico que usando ADN.

Una de las ventajas de este método es que la sonda trabaja consistentemente en una amplia variedad de muestras biológicas, lo que habitualmente no sucede con otros métodos moleculares de detección.

Otro aspecto importante es el tiempo requerido para la detección. El método desarrollado en la presente se ajusta a los mejores tiempos presentados para los restantes métodos moleculares, aún cuando el tipo de muestra requiera una etapa de enriquecimiento antes del análisis. La rapidez y la fiabilidad del método pueden determinar el tratamiento apropiado y oportuno de una contaminación yZo infección desde perspectivas tanto clínica como de seguridad alimentarla.

Otro aspecto de la presente Invención se refiere al desarrollo de un estuche basado en la aplicación de esta sonda a la hibridación ¡n sltu con fluorescencia (FISH), permitiendo la detección de Sa/mone/Za en una amplia gama de muestras biológicas, de un modo inmediato y simple.

En una realización preferida de la presente invención, la sonda de PNA descrita en la presente permite la detección de la secuencia diana en rARN, en rADN o en secuencias complementarlas del rARN de Sa/mone/Za.

En una realización más preferible de la presente invención, las secuencias previamente descritas están conectadas a al menos un tipo de fracción detectable. El tipo de fracción detectable que se va a usar se puede seleccionar de uno de los siguientes grupos: un conjugado, un sistema de detección ramificado, un cromóforo, un fluoróforo, un radioisótopo, una... [Seguir leyendo]

1. Sonda de PNA para la detección y/o cuantificación de SaZmoneZZa, caracterizada por que comprende SEQ ID No. 1 - 5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3'.

2. Sonda de PNA según la reivindicación 1, para detectar la secuencia diana en rARN, rADN o las secuencias complementarias a rARN de Sa/mone/Za.

3. Sonda de PNA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada por que está conectada a al menos un tipo de fracción detectable, seleccionada de uno de los siguientes grupos: un conjugado, un sistema de detección ramificado, un cromóforo, un fluoróforo, un radioisótopo, una enzima, un hapteno o un compuesto luminiscente.

4. Sonda de PNA según la reivindicación 3, en la que dicho grupo de fluoróforos es al menos uno de los siguientes: fluoróforos de la serie Alexa, la serie Alexa Fluor, cianinas, 5-(y 6)-carboxi-2',7'-diclorof!uoresceína, la 5-ROX (5- carboxi-X-rodamina, sal de trietilamonio).

5. Estuche para la detección de SaZmoneZZa, que comprende al menos una de las sondas de PNA descritas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Estuche según la reivindicación 5, que comprende además al menos una de las siguientes soluciones: una solución de fijación, una solución de hibridación y una solución de lavado.

7. Estuche según la reivindicación 6, en el que dicha solución de fijación comprende paraformaldehído y etanol, preferiblemente 2-8% (pesoZvolumen) de paraformaldehído y 25-90% (volumenZvolumen) de etanol.

8. Estuche según la reivindicación 6, en el que dicha solución de hibridación comprende formamida.

9. Un método para la detección de SaZmoneZZa, caracterizado por que usa las sondas de PNA descritas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y comprende las siguientes etapas:

- contacto de la sonda de PNA con las muestras biológicas;

- hibridación de la sonda de PNA con la secuencia diana de los microorganismos presentes en las muestras mencionadas;

- detección de la hibridación como una indicación de la detección y la cuantificación mencionadas de las muestras mencionadas;

en donde la hibridación de la sonda de PNA se realiza cubriendo la muestra biológica con una solución de hibridación que comprende: 10% (pesoZvolumen) de sulfato de dextrano; NaCI 10 ml\ZI; 30% (volumenZvolumen) de formamida; 0,1% (pesoZvolumen) de pirofosfato sódico; 0,2% (pesoZvolumen) de polivinilpirrolidona; 0,2% (pesoZvolumen) de Ficoll; EDTA disódico 5 mM; 0,1% (volumenZvolumen) de Tritón X-100; Tris-HCI 50 mM, pH 7,5; y 200 nM de sonda de PNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la muestra biológica se deriva de sangre, aire, alimento, agua o biopsias y no contiene otros ácidos nucleicos distintos a los de SaZmoneZZa que comprenden la secuencia diana para las sondas de PNA descritas en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que la muestra biológica se sumerge en una solución de fijación que comprende paraformaldehído y etanol, preferiblemente 2-8% (pesoZvolumen) de paraformaldehído y 25-90% (volumenZvolumen) de etanol.

12. Método según la reivindicación 9, en el que la hibridación de la sonda de PNA se realiza a una temperatura entre 53°C y 59°C, preferiblemente 57°C.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que después de la hibridación de la sonda de PNA hay una etapa de lavado realizada con una solución precalentada que comprende Tris Base 5 mM; NaCI 15 mM y 1% (volumenZvolumen) de Tritón X-100, pH 10.

14. Método según la reivindicación 9, en el que la detección de la hibridación se produce mediante fluorescencia.

15. Sondas de PNA como las descritas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para el uso en la detección

de Sa/rnone//a spp. en muestras biológicas.

16. El estuche que se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para el uso en la detección de Sa/rnone//a spp. en muestras biológicas.