Sistema de vector de ASLV.

ARN retroviral con una zona 5' que presenta una región R y una región U5 del Virus de la Leucosis/Sarcoma Aviar (ASLV) y dispuesto en 3' con respecto a esto un sitio de unión de cebador (PBS),

una señal de empaquetamiento (y), un casete de expresión, una región U3 3' y una región R, caracterizado por que la región U3 3' presenta una secuencia de nucleótidos correspondiente a la SEC ID Nº: 1, de la cual están delecionados al menos los nucleótidos Nº 28 hasta el Nº 186 inclusive, por lo que se elimina la actividad promotora y potenciadora de la región U3 3' y por que no están contenidas secuencias de ácido nucleico que codifiquen al menos en parte proteínas estructurales virales o un sitio donador de empalme (SD).

Sistema de vector de ASLV

A continuación se describe un vector autoinactivante (SIN) viral a base del Virus de la Leucosis/Sarcoma Aviar (ASLV), partículas virales que contienen este vector, un sistema de separación-empaquetamiento que comprende o que está compuesto del vector SIN, un primer plásmido auxiliar que sirve para la expresión de la proteína de fusión gag-pol viral y un segundo plásmido auxiliar que sirve para la expresión de la proteína de envoltura (env) retroviral, así como un procedimiento para la producción de la partícula viral mediante el sistema de separación- empaquetamiento, particularmente mediante expresión en células humanas cultivadas. Además, las partículas virales se usan como medicamento, en particular para la transferencia de un transgén a células, así como para la producción del medicamento. El primer y el segundo plásmido auxiliar, por ejemplo contenidos en una línea celular de empaquetamiento o transfectados de forma transitoria, sirven para la generación de partículas virales que no se replican (incompetentes en cuanto a RCR), que contienen ARN con una LTR SIN de acuerdo con la invención en el extremo 3', pudiendo presentar el ARN una sección terapéuticamente eficaz que se denomina, por ejemplo, transgén. Esta LTR SIN 3' incluye una extensa deleción de la región U3 que se copia durante la transcripción inversa en la LTR 5'. Para la expresión de un transgén que, por ejemplo, para el uso para la terapia génica puede ser un gen humano o heterólogo, el vector SIN viral contiene, preferentemente, un casete de expresión que está dispuesto en 5' con respecto a la LTR SIN 3'.

El vector permite también en células de empaquetamiento humanas la generación de partículas virales con un elevado título y se caracteriza por que durante la transducción de células diana, en particular células humanas, mediante puesta en contacto de las células de forma extracorpórea, es decir, in vitro, o mediante administración de una partícula preparada para esto a un paciente se generan células transducidas in vivo que expresan el transgén a lo largo de un largo periodo de tiempo de forma estable o con reducido debilitamiento, siendo la frecuencia de la transformación de células diana por activación de oncogén reducida. El casete de expresión presenta en 5' delante de la secuencia de ácido nucleico que codifica el transgén un promotor y, preferentemente, en 3' con respecto a la secuencia que codifica el transgén, un elemento regulador post-transcripcional (PRE), en particular un WPRE (PRE del Virus de la Hepatitis de la Marmota Canadiense (WHV)).

Estado de la técnica

Hughes (Folia Biologika 5, 17-119 (24)) describe una serie de vectores virales a base del Virus de la Leucosis Aviar (ALV) que presentan, para la mejor producción de retrovirus con competencia de replicación (RCR), una LTR funcional. (RCAS: Replication-Competent ASLV LTR with a Splice Acceptor (LTR de ASLV con competencia de replicación con aceptor de empalme)). En este sistema, todos los componentes para la producción del virus se encuentran en un plásmido (como en el virus de longitud completa) y se incluye un posible transgén en la región no traducida (UTR) 3'.

Hu et al. (Molecular Therapy, 1617-1623 (28)) muestran que el ASLV no tiende a insertarse preferentemente dentro o cerca de proto-oncogenes y que las LTR del ASLV no tienden a activar genes adyacentes y, por tanto, llegan a la conclusión de que el ASLV forma una base adecuada para vectores virales. Se señala que una deleción de la región potenciadora (enhancer) en la LTR o la evitación de la transcripción de parte a parte a través de una señal de terminación se podría conseguir mediante una poliadenilación mejorada.

El documento EP 1 757 73 A2 describe vectores retrovirales autoinactivantes, en particular vectores lentivirales y gammarretrovirales, que se caracterizan por que un promotor fuerte sustituye el elemento U3 en la LTR 5' para controlar la transcripción del ARNm de longitud completa para el empaquetamiento.

Schambach et al. en Molecular Therapy 391-4 (26) describen vectores autoinactivantes gammarretrovirales y lentivirales que para la terapia génica contienen un casete de expresión de 6-metilguanin-ADN-metiltransferasa.

Hildinger ef al. en J. Virol. 483-489 (1999) describen que la presencia de un donador de empalme en combinación con la señal de empaquetamiento es una condición esencial para la generación de altos títulos de partículas virales en células de empaquetamiento.

Hu et al. (Human Gene Therapy 691-7 (27)) y Mitchell et al. (Píos Biology, e234, 24) muestran que el ASLV no tiende a insertarse preferentemente dentro o cerca de proto-oncogenes, en particular sin clara preferencia por zonas próximas al promotor. Por consiguiente, se tiene que estimar menor el riesgo de mutagénesis de inserción en comparación con los sistemas de vector usados clínicamente del virus de la leucemia murina (MLV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se señala que una deleción de la región potenciadora (enhancer) en la LTR o la evitación de la transcripción de parte a parte a través de una señal de terminación sería deseable. A causa de la arquitectura del vector (1 plásmido, replicante), por norma general, este sistema no es adecuado para aplicaciones clínicas.

Hu et al. muestran que los vectores virales derivados de ASLV con LTR intactas en células de mamífero no se replican. No está clara la causa exacta de esto.

A causa de la arquitectura retroviral de 2 LTR, los retrovirus tienen señales de poliA intrínsecamente débiles. Para vectores lentivirales es sabido que mediante la transcripción de parte a parte del extremo 3' del vector viral insertado puede conducirá la activación génica indeseada, así por ejemplo Zaiss etal. (Journal of Virology 729-7219 (22)) y Schambach, Baum et al. (Molecular Therapy 27, 15(6): 1167-73). Esto es importante también debido a que la región U3, además de elementos promotores/potenciadores, contiene también reforzadores de la poliadenilación y, de este modo, las posibles deleciones para cada familia de virus se tienen que validar de nuevo con respecto a actividad potenciadora residual y eficiencia de la poliadenilación.

Para vectores gammarretrovirales, Kraunus etal. (Gene Therapy 568-1578 (24)) proponen delecionar toda la zona del elemento potenciador y del promotor de la región U3 3' y dejar solo los primeros 22 pb cadena arriba del potenciador y los últimos 14 pb cadena abajo. En el ASLV o en el Virus del Sarcoma de Rous (RSV), la región LTR se complica por una región R muy corta, de tal manera que la señal de poliA (AATAAA) llega a encontrarse en la región U3. Esto es muy poco habitual para retrovirus (localizados por norma en la región R) y dificulta la construcción de un vector SIN.

Aubert et al. (The J. of Cell Biology 113, 497-56 (1991) y Flamant et al. (Journal of General Virology 74, 39-46 (1993)) describen deleciones de la región U3 de ALV de -149 a -15, en relación con la región R, o de -149 a -15 y -98 a -59, también en relación con la región R. En todas estas regiones U3 están contenidos todavía elementos potenciadores remanentes (Cullen etal., MCB, 1985, 438-47), lo que es problemático para posibles aplicaciones clínicas. De hecho, estos elementos potenciadores pueden regular erróneamente mediante mutagénesis de inserción posiblemente genes adyacentes (por ejemplo, oncogenes).

Objetivo de la invención

Por tanto, la invención se plantea como objetivo facilitar un sistema de separación-empaquetamiento que se pueda emplear clínicamente para la producción en células de mamífero (por ejemplo, células humanas, por ejemplo, HEK293T) con un vector viral y plásmidos auxiliares con el que se pueda producir el vector viral empaquetado como partícula viral, en el que esté minimizado el riesgo de la recombinación hasta dar un retrovirus con competencia de replicación (RCR) y también esté minimizado el riesgo de que la inserción del vector viral conduzca a la activación de genes adyacentes de la célula diana (mutagénesis de inserción). Preferentemente, el vector viral o el sistema con plásmidos auxiliares además debe permitir la generación de partículas virales con un elevado título, habiendo de poder contener el vector viral un casete de expresión por el cual un transgén y secuencias reguladoras de genes (por ejemplo, ARNhc, miARN etc.) se transcriben y/o traduzcan de forma eficaz. Preferentemente, estos vectores se pseudotipifican con proteínas de envoltura que se pueden emplear clínicamente (por ejemplo, RD114/TR, env anfotrópico de MLV, glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVg)). Todos esos criterios se pretenden en combinación, ya que son esenciales para... [Seguir leyendo]

1. ARN retroviral con una zona 5' que presenta una región R y una región U5 del Virus de la Leucosis/Sarcoma Aviar (ASLV) y dispuesto en 3' con respecto a esto un sitio de unión de cebador (PBS), una señal de empaquetamiento (\|r), un casete de expresión, una región U3 3' y una región R, caracterizado por que la región U3 3' presenta una secuencia de nucleótidos correspondiente a la SEC ID N2:1, de la cual están delecionados al menos los nucleótidos N2 28 hasta el N2 186 inclusive, por lo que se elimina la actividad promotora y potenciadora de la región U3 3' y por que no están contenidas secuencias de ácido nucleico que codifiquen al menos en parte proteínas estructurales virales o un sitio donador de empalme (SD).

2. ARN retroviral de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que en 3' para la deleción está dispuesta una secuencia de poliadenilación.

3. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la región U3 3' presenta una secuencia de nucleótidos correspondiente a la SEC ID N2:1 y adicionalmente los nucleótidos N2 2 a N2 26 están mutados en una subsecuencia que no es una caja TATA.

4. ARN retroviral de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que los nucleótidos N2 2 a N2 26 están mutados en una secuencia TGTCTAA.

5. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que en la región U3 3' adicionalmente el nucleótido N2187 está mutado en C y el nucleótido N2189, en T.

6. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la región U3 3' presenta una secuencia de nucleótidos correspondiente a la SEC ID N2: 1, de la cual están delecionados adicionalmente los nucleótidos N2187 a N2 22.

7. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la región U3 3' presenta una secuencia correspondiente a las SEC ID N2: 2, SEC ID N2: 3 o SEC ID N2: 4 o está compuesta de las mismas.

8. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la región U3 3' inclusive la región R 3' presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos N2 3282 a N2 3372 de la SEC ID N2: 5, una secuencia correspondiente a los nucleótidos N2 3282 a N2 3356 de la SEC ID N2: 7 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos N2 3282 a N2 3372 de la SEC ID N2: 9 o está compuesta de las mismas.

9. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la deleción de la región U3 3' está sustituida por una inserción con una secuencia de nucleótidos que no presenta ninguna secuencia promotora o potenciadora.

1. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la región U3 3' presenta una secuencia de ácido nucleico insertada que codifica miARN, ARNhc, un potenciador de la poliadenilación, aislador y/o secuencia de reconocimiento para una ADN-recombinasa.

11. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el casete de expresión presenta de 5' a 3' un promotor, una secuencia de ácido nucleico que codifica un transgén y un elemento regulador post-transcripcional (PRE).

12. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la secuencia de ácido nucleico que está dispuesta en 5' limitando con el promotor codifica de 5' a 3' un elemento R, limitando directamente con esto un elemento U5 y una señal de empaquetamiento.

13. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que la secuencia de ácido nucleico que está dispuesta en 5' con respecto al casete de expresión presenta la secuencia de los nucleótidos N2 922 a 1292 de la SEC ID N2: 5 o está compuesta de la misma.

14. ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la región U3 3' presenta un sitio de ataque de integrasa en los nucleótidos 1-25 así como una señal de poliA.

15. ADN con un elemento promotor que está dispuesto funcionalmente en 5' con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores.

16. ADN de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por que la secuencia de nucleótidos que codifica ARN retroviral presenta una región R 5' y una región U5 5' con una secuencia correspondiente a los nucleótidos N2 922 a 122 de la SEC ID N2: 5 y en 3' con respecto a esto una LTR 3' con una secuencia correspondiente a los nucleótidos N2 3282 a 3452 de la SEC ID N2: 5 o con una secuencia correspondiente a los nucleótidos N2 3282 a 3436 de la

SEC ID N2: 7 o con una secuencia correspondiente a los nucleótidos N2 3282 a 3452 de la SEC ID N2: 9.

17. Partícula viral con una proteína de envoltura, caracterizada por que la partícula presenta un ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14.

18. Composición farmacéutica para su uso en la terapia génica, caracterizada por una partícula viral de acuerdo con la reivindicación 17.

19. Sistema de separación-empaquetamiento para la generación de partículas retrovirales que comprende un ADN que codifica un ARN retroviral, un primer plásmido auxiliar que codifica una proteína de fusión gag-pro-pol y un segundo plásmido auxiliar que codifica una proteína de envoltura viral, caracterizado por que el ARN retroviral presenta una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14.

2. Sistema de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado por que el ADN que codifica el ARN retroviral, el primer plásmido auxiliar y/o el segundo plásmido auxiliar están introducidos por transfección en una célula eucariota o están integrados en el genoma de una célula eucariota.

21. Sistema de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 2, caracterizado por que el primer plásmido auxiliar codifica la proteína de fusión gag-pro-pol y/o el segundo plásmido auxiliar la proteína de envoltura viral con codones que están adaptados al uso de coclones de la célula eucariota que los contiene.

22. Sistema de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado por que el primer plásmido auxiliar codifica la proteína de fusión gag-pro-pol con una secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos N2 1475 a N2 6291 de la SEC ID N2: 14.

23. Procedimiento para la producción de partículas virales mediante expresión de una proteína de fusión gag-pro-pol y de una proteína de envoltura viral en una célula de empaquetamiento, caracterizado por que el ARN retroviral en la célula de empaquetamiento se transcribe de un ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 o 16.

24. Partícula viral de acuerdo con la reivindicación 17 para el uso en la terapia génica.

25. Partícula viral de acuerdo con la reivindicación 24 para el uso en la terapia génica para la modificación genética de células adultas somáticas, células madre hematopoyéticas o células madre embrionarias no humanas.

26. Transducción de células diana mediante puesta en contacto de las células in vitro con un ARN retroviral de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14.