Proteínas de fusión de transferrina modificadas.

Una proteína de fusión que comprende una proteína transferrina modificada (mTf) fusionada con una molécula de péptido de tipo glucagón 1 (GLP-1),

en la que la proteína mTf es transferrina humana de SEC ID Nº: 3 modificada por sustitución, deleción o inserción de aminoácidos de entre 1 y 30 aminoácidos, y en la que la proteína mTf muestra glucosilación reducida, unión a metal reducida o unión a receptor reducida en comparación con transferrina humana de SEC ID Nº: 3.

Proteínas de fusión de transferrina modificadas

Campo de la invención La presente invención se refiere a proteínas o péptidos terapéuticos con estabilidad en suero extendida o semivida circulatoria in vivo fusionada con o insertada en una molécula transferrina modificada para reducir o inhibir la glucosilación, unión a hierro y/o unión al receptor de transferrina. Específicamente, la presente invención incluye GLP-1 fusionada con o insertada en una molécula de transferrina modificada.

Antecedentes de la invención Las proteínas o los péptidos terapéuticos en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante son normalmente moléculas lábiles que muestran periodos cortos de estabilidad en suero o semividas circulatorias in vivo cortas. Además, estas moléculas son con frecuencia extremadamente lábiles cuando se formulan, particularmente cuando se formulan en soluciones acuosas para fines de diagnóstico y terapéuticos.

Existen pocas soluciones prácticas para extender o promover la estabilidad in vivo o in vitro de moléculas terapéuticas proteicas. El polietilenglicol (PEG) es una sustancia que puede unirse a una proteína, dando como resultado actividad sostenida, de acción más larga, de la proteína. Si la actividad de una proteína se prolonga por la unión con PEG, la frecuencia con la que es necesario administrar la proteína puede reducirse. La unión a PEG, sin embargo, con frecuencia reduce o destruye la actividad terapéutica de la proteína. Aunque en algunos casos la unión con PEG puede reducir la inmunogenicidad de la proteína, en otros casos puede aumentar la inmunogenicidad.

Las proteínas o los péptidos terapéuticos también se han estabilizado mediante fusión con una proteína capaz de extender la semivida circulatoria in vivo de la proteína terapéutica. Por ejemplo, las proteínas terapéuticas fusionadas con albúmina o con fragmentos de anticuerpos pueden mostrar semivida circulatoria in vivo extendida en comparación con la proteína terapéutica en el estado no fusionado. Véase Patentes de Estados Unidos 5.876.969 y

5.766.883.

Otra proteína del suero, transferrina humana glucosilada (Tf) también se ha usado para realizar fusiones con proteínas terapéuticas para dirigir el suministro al interior de células o para transportar agentes a través de la barrera hematoencefálica. Estas proteínas de fusión que comprenden Tf humana glucosilada se han usado para dirigirse al factor de crecimiento nervioso (NGF) o factor neurotrófico ciliar (CNTF) a través de la barrera hematoencefálica fusionando Tf de longitud completa con el agente. Véase Patentes de Estados Unidos 5.672.683 y 5.977.307. En estas proteínas de fusión, la parte Tf de la molécula está glucosilada y se une a dos átomos de hierro, lo que es necesario para la unión de Tf con su receptor en una célula y, de acuerdo con los inventores de estas patentes, para dirigir el suministro del resto de NGF o CNTF a través de la barrera hematoencefálica. También se han producido proteínas de fusión de transferrina insertando una secuencia diana de proteasa del VIH-1 en bucles expuestos en superficie de transferrina glucosilada para investigar la capacidad para producir otra forma de fusión de Tf para suministro dirigido al interior de una célula mediante el receptor de Tf (Ali et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (34) : 2406624073) .

La transferrina del suero (Tf) es una glucoproteína monomérica con un peso molecular de 80.000 Dalton que se une al hierro en la circulación y lo transporta a diversos tejidos mediante el receptor de transferrina (TfR) (Aisen et al. (1980) Ann. Rev. Biochem. 49: 357-393; MacGillivray et al. (1981) J. Biol. Chem. 258: 3543-3553, Patente de Estados Unidos 5.026.651) . Tf es una de las moléculas del suero más habituales, que comprende hasta aproximadamente el 5-10 % de las proteínas de suero totales. Se produce transferrina deficiente en carbohidratos en niveles elevados en la sangre de individuos alcohólicos y muestra una semivida mayor (aproximadamente 14-17 días) que la de la transferrina glucosilada (aproximadamente 7-10 días) . Véase van Eijk et al. (1983) Clin. Chim. Acta 132: 167-171, Stibler (1991) Clin. Chem. 37: 2029-2037 (1991) , Arndt (2001) Clin. Chem. 47 (1) : 13-27 y Stibler et al.

en “Carbohydrate-deficient consumption”, Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann et al.) , Pergamon, 1988, Vol. 55 71, páginas 353-357) .

La estructura de Tf se ha caracterizado bien y se ha dilucidado el mecanismo de la unión al receptor, unión a hierro y liberación y unión a ión carbonato (Patentes de Estados Unidos 5.026.651, 5.986.067 y MacGillivray et al. (1983) J. Biol. Chem. 258 (6) : 3543-3546) .

La transferrina y anticuerpos que se unen con el receptor de transferrina también se han usado para suministrar o transportar agentes tóxicos a células tumorales como terapia de cáncer (Baselga y Mendelsohn, 1994) , y la transferrina se ha usado como un vector de terapia génica no viral para suministrar ADN a células (Frank et al., 1994; Wagner et al., 1992) . La capacidad para suministrar proteínas al sistema nervioso central (SNC) usando el 65 receptor de transferrina como el punto de entrada se ha demostrado con varias proteínas y péptidos incluyendo CD4 (Walus et al., 1996) , factor neurotrófico derivado de cerebro (Pardridge et al., 1994) , factor neurotrófico derivado de

células gliales (Albeck et al.) , un análogo peptídico vasointestinal (Bickel et al., 1993) , un péptido beta amiloide (Saito et al., 1995) y un oligonucleótido antisentido (Pardridge et al., 1995) .

Las proteínas de fusión de transferrina, sin embargo, no se han modificado o desarrollado técnicamente para 5 extender la semivida circulatoria in vivo de una proteína o péptido terapéutico o para aumentar la biodisponibilidad reduciendo o inhibiendo la glucosilación del resto de Tf ni para reducir o prevenir la unión al receptor de Tf y/o hierro.

Sumario de la invención Como se describe en más detalle posteriormente, la presente invención incluye proteínas de fusión Tf modificadas que comprenden péptido de tipo glucagón (GLP-1) , en las que la parte de Tf se modifica técnicamente para extender la semivida circulatoria in vivo o la biodisponibilidad de la molécula. La invención también incluye formulaciones farmacéuticas y composiciones que comprenden las proteínas de fusión y moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de Tf modificadas. La solicitud describe además métodos para extender la estabilidad en suero, semivida en circulación in vivo y biodisponibilidad de GLP-1 mediante fusión con una transferrina modificada. También se describen en el presente documento métodos para tratar a un paciente con una proteína de fusión de Tf modificada.

Preferentemente, las proteínas de fusión de Tf modificadas comprenden un resto de Tf de transferrina humana que se ha modificado para reducir o prevenir la glucosilación y/o unión a hierro y receptor.

La presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden GLP-1 fusionadas con o insertadas en moléculas de transferrina modificadas. Otras proteínas terapéuticas descritas en el presente documento incluyen interferón β (IFN-β) , péptido mimético de EPO (eritropoyetina) (EMP1) , y T-20.

También se describen en el presente documento proteínas de fusión que comprenden un fragmento de receptor de toxina soluble que se une a una toxina fusionada con o insertada en la transferrina o moléculas de transferrina modificadas. El receptor de toxina soluble puede ser sinaptotagmina 1 y el fragmento soluble es los aminoácidos 153 (SEC ID Nº: 4) .

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra un alineamiento de los Dominios N y C de transferrina (Tf) Humana (Hu) (SEC ID Nº: 3) con similitudes e identidades destacadas.

Las Figuras 2A-2B muestran un alineamiento de secuencias de transferrina de diferentes especies. Sombreado Claro: Similitud; Sombreado Oscuro: Identidad (SEC ID Nº: 84-90) .

La Figura 3 muestra la localización de varios sitos de inserción expuestos en superficie de Tf para proteínas, polipéptidos o péptidos terapéuticos.

La Figura 4 muestra la farmacocinética de mTf-T20 en dos conejos.

Descripción detallada

Descripción general

La presente invención se basa en parte en el hallazgo por los inventores de que pueden estabilizarse proteínas terapéuticas para extender su semivida en suero y/o actividad in vivo fusionando genéticamente las proteínas terapéuticas a transferrina, transferrina modificada, o una parte de transferrina o transferrina modificada suficiente para extender la semivida de la proteína terapéutica... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión que comprende una proteína transferrina modificada (mTf) fusionada con una molécula de péptido de tipo glucagón 1 (GLP-1) , en la que la proteína mTf es transferrina humana de SEC ID Nº: 3 modificada por sustitución, deleción o inserción de aminoácidos de entre 1 y 30 aminoácidos, y en la que la proteína mTf muestra glucosilación reducida, unión a metal reducida o unión a receptor reducida en comparación con transferrina humana de SEC ID Nº: 3.

2. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la molécula de GLP-1 está fusionada con el extremo C terminal de mTf, o está fusionada con el extremo N terminal de mTf, o está insertada en al menos un bucle de la mTf, o reemplaza al menos un bucle de la mTf.

3. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína mTf tiene afinidad reducida por o no se une a un receptor de Tf (TfR) .

4. Una proteína de fusión que comprende una proteína transferrina modificada (mTf) fusionada con una molécula de péptido de tipo glucagón 1 (GLP-1) , en la que la proteína mTf es una proteína Tf modificada por sustitución, deleción

o inserción de aminoácidos de entre 1 y 30 aminoácidos, y tiene afinidad reducida por o no se une a hierro en comparación con la proteína Tf; y en la que la proteína Tf se selecciona del grupo que consiste en Tf humana (SEC ID Nº. 3) , Tf de conejo (SEC ID Nº. 84) , Tf de rata (SEC ID Nº. 85) , Tf de ratón (SEC ID Nº. 86) , Tf de caballo (SEC ID Nº. 87) , Tf bovina (SEC ID Nº. 88) , Tf de cerdo (SEC ID Nº. 89) y Tf de pollo (SEC ID Nº. 90) .

5. Una proteína de fusión que comprende una proteína transferrina modificada (mTf) fusionada con una molécula de péptido de tipo glucagón 1 (GLP-1) , en la que la proteína mTf es transferrina humana de SEC ID Nº: 3 modificada por sustitución, deleción o inserción de aminoácidos de entre 1 y 30 aminoácidos, y en la que dicha proteína mTf muestra glucosilación reducida o no muestra glucosilación en comparación con la transferrina humana de SEC ID Nº: 3.

6. Una proteína de fusión de la reivindicación 1 o de la reivindicación 5, en la que dicha proteína mTf comprende al menos una mutación que evita la glucosilación.

7. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, que se expresa en presencia de tunicamicina.

8. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, que comprende además un péptido enlazador.

9. Una proteína de fusión de la reivindicación 8, en la que el péptido enlazador une la molécula de GLP-1 a mTf.

10. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína mTf comprende al menos una sustitución, una deleción o una adición de aminoácidos en la región bisagra.

11. Una proteína de fusión de la reivindicación 10, en la que dicha región bisagra se selecciona del grupo que consiste en del resto 94 al resto 96 de SEC ID Nº: 3, del resto 245 al resto 247 de SEC ID Nº: 3, del resto 316 al resto 318 de SEC ID Nº: 3, del resto 425 al resto 427 de SEC ID Nº: 3, del resto 581 al resto 582 de SEC ID Nº: 3, y del resto 652 al resto 658 de SEC ID Nº: 3.

12. Una proteína de fusión de la reivindicación 6, en la que la mutación está dentro del sitio de glucosilación ligado a N que comprende la secuencia Asn-X-Ser/Thr en la que X puede ser un aminoácido excepto prolina.

13. Una proteína de fusión de la reivindicación 12, en la que el sitio de glucosilación ligado a N se selecciona del grupo que consiste en los aminoácidos N413 de SEC ID Nº: 3 y N611 de SEC ID Nº: 3.

14. Una proteína de fusión de las reivindicaciones 1 o 3, en la que el mTf comprende al menos una sustitución, una deleción o una adición de aminoácidos en un resto de aminoácido en SEC ID Nº: 3 seleccionado del grupo que consiste en Asp 63, Gly 65, Tyr 95, Tyr 188, Lys 206, His 207, His 249, Asp 392, Tyr 426, Tyr 514, Tyr 517, His 585, Thr 120, Arg 124, Ala 126, Gly 127, Thr 452, Arg 456, Ala 458 y Gly 459.

15. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que el resto de prolina C terminal o el bucle de cisteína terminal de mTf están suprimidos.

16. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína mTf muestra glucosilación reducida en comparación con transferrina humana de SEC ID Nº. 3, y en la que la semivida en suero de la molécula de GLP-1 aumenta por encima de la semivida en suero de la molécula de GLP-1 en un estado no fusionado.

17. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína mTf tiene un dominio N terminal en cada extremo de la proteína.

18. La proteína de fusión de la reivindicación 17, en la que la molécula de GLP-1 está fusionada con cada dominio N terminal de la proteína mTf.

19. Una proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que se inserta una molécula de GLP-1 en cada uno de los 5 bucles de transferrina.

20. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la molécula de GLP-1 se ha modificado para evitar la escisión de dipeptidilo.

21. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la molécula de GLP-1 comprende GLP-1 con una o más adiciones o sustituciones de aminoácidos en el extremo N terminal.

22. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la molécula de GLP-1 tiene una modificación química del grupo amino N terminal.

23. La proteína de fusión de la reivindicación 21, en la que la molécula de GLP-1 está fusionada con proteína transferrina modificada en el extremo N terminal.

24. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que en la que la molécula de GLP-1 está insertada en el domino N o el dominio C de la mTf en uno o más de los sitios en SEC ID Nº: 3 seleccionados del grupo que consiste en Asp33, Asn55, Asn75, Asp90, Gly257, Lys280, His289, Ser298, Ser105, Glu141, Asp166, Gln184, Asp197, Lys217, Thr231 y Cys241.

25. Una proteína de fusión de la reivindicación 24, en la que la molécula de GLP-1 está insertada en el domino N de mTf y está insertada además en la mTf en uno o más sitios en SEC ID Nº: 3 seleccionados de Asp33, Asn55, Asn75, Asp90, Gly257, Lys280, His289, Ser298, Ser105, Glu141, Asp166, Gln184, Asp197, Lys217, Thr231 y Cys241.

26. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la mTf está modificada adicionalmente por deleción de la Pro C terminal.

27. Una proteína de fusión de la reivindicación 26, en la que mTf está modificada adicionalmente por deleción de Arg-Arg adyacente a la Pro C terminal.

28. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la mTf está modificada adicionalmente por eliminación del enlace disulfuro entre Cys402 y Cys674 de SEC ID Nº: 3.

29. Una proteína de fusión de las reivindicaciones 26 o 27, en la que la mTf está modificada adicionalmente mutando Cys402 y Cys674 de SEC ID Nº: 3 en restos de Gly.

30. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la molécula de GLP-1 está insertada en uno o más de los bucles en SEC ID Nº: 3 seleccionados del grupo que consiste en N1 (286-292) , N2 (162-170) , C1 (489-495) y C2 (623628) .

31. Una proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína mTf comprende un único domino N terminal.

32. Una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la molécula de GLP-1 es GLP-1 (7-37) o GLP-1 (7-36) .

33. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 32, en la que la molécula de GLP-1 es GLP-1 (7-37) que consiste en SEC ID Nº: 6 o GLP-1 (7-36) que consiste en los aminoácidos 1-30 de SEC ID Nº: 6.

34. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 32, en la que la Ala en la segunda posición en SEC ID Nº: 6 se ha mutado.

35. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 34, en la que Ala en la segunda posición en SEC ID Nº: 6 se ha mutado a Gly, Ser o Val.

36. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

37. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 36.

38. Una célula hospedadora que comprende un vector de la reivindicación 37.

39. Una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 36.

40. Un método para expresar una proteína de fusión de mTf que comprende cultivar una célula hospedadora de las reivindicaciones 38 o 39 en condiciones que expresen la proteína de fusión codificada.

41. Una célula hospedadora de las reivindicaciones 38 o 40, en la que la célula es procariota o eucariota.

42. Una célula hospedadora de la reivindicación 41, en la que la célula es una célula de levadura.

43. Un animal transgénico no humano que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 36.

44. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 y un vehículo.

45. Un método para producir una proteína de fusión de mTf que comprende aislar una proteína de fusión de un animal transgénico de la reivindicación 43.

46. Una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35 para uso en un método de tratamiento médico.

47. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 46 para tratar un nivel elevado de glucosa en comparación con un sujeto sano.

48. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 47, en la que el nivel elevado de glucosa se asocia a diabetes.

49. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 48, en la que la diabetes es diabetes de Tipo II.

50. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 46 para tratar la insuficiencia cardiaca congestiva.

51. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 46 para tratar la obesidad.

52. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 46 para regular el nivel de glucosa en un sujeto.