Proteasas no citotóxicas modificadas.

Un polipéptido que comprende:

(a) una proteasa no citotóxica que es capaz de escindir una proteína SNARE;

(b) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa no citotóxica desde dentro de un endosoma de una célula de mamífero, a través de la membrana endosómica del mismo hasta el citosol de la célula de mamífero;

(c) un primer sitio de escisión destructivo que es escindible por una segunda proteasa y no por la proteasa no citotóxica y en que después de su escisión por la segunda proteasa, el polipéptido tiene una potencia reducida medible por una capacidad reducida de escindir dicha proteína SNARE y/o una capacidad reducida de translocar dicha proteasa no citotóxica, en que dicho primer sitio de escisión destructivo es escindible por una proteasa seleccionada entre: una proteasa circulante, una proteasa sérica, una proteasa de la cascada de coagulación sanguínea; una proteasa asociada a tejidos, una metaloproteasa matricial (MMP), una MMP muscular; o una proteasa intracelular ausente en las células nerviosas;

(d) una fracción de direccionamiento (TM) que se une a un sitio de unión presente en una célula nerviosa de la unión neuromuscular, en que el sitio de unión es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula nerviosa; y

(e) con la condición de que dicho primer sitio de escisión destructivo no esté localizado dentro de dicha TM.

Proteasas no citotóxicas modificadas

[1] La presente invención se refiere a proteasas no citotóxicas con eficacia mejorada y a la construcción de las mismas.

[2] Las proteasas no citotóxicas son un grupo de proteasas claramente reconocido que actúan sobre las células diana incapacitando la función celular. Como aspecto importante, las proteasas no citotóxicas no destruyen

las células diana sobre las que actúan. Algunos de los ejemplos mejor conocidos de proteasas no citotóxicas incluyen las neurotoxinas clostridiales (por ejemplo, la neurotoxina botulínica, también conocida como BOTOX) y las proteasas de IgA.

[3] Las proteasas no citotóxicas actúan escindiendo proteolíticamente las proteínas de transporte 15 intracelular conocidas como proteínas SNARE (por ejemplo, SNAP-25, VAMP o sintaxina), véase Gerald K. (22)

"Cell and Molecular Biology" (4.a edición) John Wiley & Sons, Inc. El acrónimo SNARE deriva del término: receptor de unión a NSF soluble (en inglés, Soluble NSF Attachment Receptor), en que NSF significa factor sensible a N- etilmaleimida. Las proteínas SNARE son esenciales para la formación de vesículas intracelulares y, por lo tanto, para la secreción de moléculas por una célula mediante el transporte de vesículas. Por consiguiente, una vez 2 suministrada a una célula diana, la proteasa no citotóxica es capaz de inhibir la secreción celular en la célula diana.

[4] Las proteasas no citotóxicas pueden emplearse en su forma nativa o sustancialmente nativa (es decir, como holotoxinas, tales como BOTOX), en cuyo caso, el direccionamiento de las proteasas a tipos de células específicos depende de (i) la administración localizada de la proteasa y/o (ii) la capacidad de unión intrínseca de la

proteasa nativa. Alternativamente, las proteasas no citotóxicas pueden emplearse en una forma redirigida en la que la proteasa nativa se modifica para incluir un ligando exógeno conocido como fracción de direccionamiento (TM, del inglés, Targeting Moiety). La TM se selecciona de modo que proporcione especificidad de unión para una célula diana deseada y, como parte del proceso de redireccionamiento, la porción de unión nativa de la proteasa no citotóxica puede eliminarse. La tecnología del redireccionamiento se describe, por ejemplo, en los documentos: EP- 3 B-689459, EP-B-939818, US 6.461.617, US 7.192.596, EP-B-82651, US 5.989.545, US 6.395.513, US 6.962.73, EP-B-996468, US 7.52.72, EP-B-117794 y US 6.632.44.

[5] A la vista de la gran distribución de las proteínas SNARE, las proteasas no citotóxicas se han empleado con éxito en una amplia gama de tratamientos.

[6] A modo de ejemplo, se menciona William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 24), que describe el uso de toxinas clostridiales tales como las neurotoxinas botulínicas (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, y la neurotoxina tetánica (TeNT), para inhibir la transmisión neuronal en una amplia diversidad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas; como ejemplo, BOTOX

está aprobada actualmente como producto terapéutico para las indicaciones siguientes: acalasia, espasticidad en adultos, fisura anal, dolor de espalda, blefaroespasmo, bruxismo, distonía cervical, temblor hereditario, líneas glabelares o líneas faciales hipercinéticas, dolor de cabeza, espasmo hemifacial, hiperactividad de la vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, líneas labiales nasales, disfonía espasmódica, estrabismo y trastornos del nervio Vil. Además, se han descrito tratamientos con toxinas clostridiales 45 para el tratamiento de trastornos neuromusculares (véase el documento US 6.872.397); para el tratamiento de trastornos uterinos (véase el documento US24/175399); para el tratamiento de úlceras y la enfermedad del reflujo gastroesofágico (véase el documento US24/86531); para el tratamiento de la distonía (véase el documento US 6.319.55); para el tratamiento de trastornos oculares (véase el documento US24/234532); para el tratamiento del blefaroespasmo (véase el documento US24/15174); para el tratamiento del estrabismo 5 (véase el documento US24/126396); para el tratamiento del dolor (véanse los documentos US 6.869.61, US 6.641.82, US 6.464.986, US 6.113.915); para el tratamiento de la fibromialgia (véanse los documentos US 6.623.742, US24/62776); para el tratamiento del dolor en la región lumbar (véase el documento US24/37852); para el tratamiento de lesiones musculares (véase el documento 6.423.319); para el tratamiento del dolor de cabeza sinusal (véase el documento US 6.838.434); para el tratamiento del dolor de cabeza tensional 55 (véase el documento US 6.776.992); para el tratamiento del dolor de cabeza (véase el documento US 6.458.365); para la reducción de la migraña (véase el documento US 5.714.469); para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (véase el documento US 6.767.544); para el tratamiento de trastornos neurológicos tales como la enfermedad de Parkinson (véanse los documentos US 6.62.415, US 6.36.43); para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos (véanse los documentos

[7] US24/1861, US23/211121); para el tratamiento de trastornos endocrinos (véase el documento US 6.827.931); para el tratamiento de trastornos tiroideos (véase el documento US 6.74.321); para el tratamiento de glándulas sudoríparas bajo influencia colinérgica (véase el documento US 6.683.49); para el

tratamiento de la diabetes (véanse los documentos US 6.337.75, US 6.416.765); para el tratamiento de un trastorno pancreático (véanse los documentos US 6.261.572, US 6.143.36); para el tratamiento de cánceres tales como tumores óseos (véanse los documentos US 6.565.87, US 6.368.65, US 6.139.845, US25/31648); para el tratamiento de trastornos auditivos (véanse los documentos US 6.358.926, US 6.265.379); para el tratamiento de trastornos autónomos tales como trastornos de los músculos gastrointestinales y disfundón de otros músculos lisos 1 (véase el documento US 5.437.291); para el tratamiento de lesiones cutáneas asociadas con trastornos prollferatlvos de células cutáneas (véase el documento US 5,67,484); para la gestión de trastornos Inflamatorios neurogénlcos (véase el documento US 6.63.768); para la reducción de la caída del cabello y la estimulación de su crecimiento (véase el documento US 6.299.893); para el tratamiento de la boca caída (véase el documento US 6.358.917); para la reducción del apetito (véase el documento US24/4253274); para tratamientos y procedimientos dentales 15 (véase el documento US24/115139); para el tratamiento de trastornos y afecciones neuromusculares (véase el documento US22/1138); para el tratamiento de diversos trastornos y afecciones y el dolor asociado (véase el documento US24/13692); para el tratamiento del dolor (véase el documento W96/33274); para el tratamiento de afecciones que resultan de la hipersecreción de moco, tales como asma y EPOC (véase el documento WO/1598); para el tratamiento de afecciones no neuronales tales como Inflamación, afecciones endocrinas, 2 afecciones exocrlnas, afecciones inmunológicas, afecciones cardiovasculares, afecciones óseas (véase el documento WO1/21213).

[8] Se anticipa que el uso de proteasas no citotóxlcas, tales como las neurotoxinas clostridiales (por ejemplo, BoNT y TeNT), en tratamientos terapéuticos y cosméticos en humanos y en otros mamíferos va a

expandirse a una gama cada vez más amplia de enfermedades y dolencias que pueden beneficiarse de las propiedades de estas toxinas.

[9] La administración de una proteasa no citotóxica (incluidos productos clínicos de neurotoxinas clostridiales nativas) puede ser problemática debido a la necesidad de dosis mayores requeridas para un efecto

beneficioso. Unas dosis mayores pueden aumentar la probabilidad de que la proteasa se desplace, por ejemplo, a través de los líquidos intersticiales y los sistemas circulatorios (tales como el sistema cardiovascular y el sistema linfático) del cuerpo, lo que resulta en una dispersión no deseada de la proteasa a zonas que no son diana del tratamiento. Tal dispersión puede dar lugar a efectos secundarios no deseados, tales como la inhibición de la secreción celular en células que no son diana del tratamiento (por ejemplo, la inhibición de la liberación de 35 neurotransmisores en neuronas que no son diana del tratamiento o la parálisis de un músculo que no es diana del tratamiento). A modo de ejemplo específico, en un paciente al que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una BoNT en los músculos del cuello a causa de una tortícolis puede producirse disfagia debido a la dispersión de la proteasa en la bucofaringe. De manera similar,... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende:

(a) una proteasa no citotóxica que es capaz de escindir una proteína SNARE;

(b) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa no citotóxica desde dentro de un endosoma de una célula de mamífero, a través de la membrana endosómica del mismo hasta el citosol de la célula de mamífero;

(c) un primer sitio de escisión destructivo que es escindióle por una segunda proteasa y no por la proteasa no citotóxica y en que después de su escisión por la segunda proteasa, el polipéptido tiene una potencia reducida medible por una capacidad reducida de escindir dicha proteína SNARE y/o una capacidad reducida de translocar dicha proteasa no citotóxica, en que dicho primer sitio de escisión destructivo es escindióle por una proteasa

seleccionada entre: una proteasa circulante, una proteasa sérica, una proteasa de la cascada de coagulación sanguínea; una proteasa asociada a tejidos, una metaloproteasa matricial (MMP), una MMP muscular; o una proteasa intracelular ausente en las células nerviosas;

(d) una fracción de direccionamiento (TM) que se une a un sitio de unión presente en una célula nerviosa de la unión 2 neuromuscular, en que el sitio de unión es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse en un endosoma

dentro de la célula nerviosa; y

(e) con la condición de que dicho primer sitio de escisión destructivo no esté localizado dentro de dicha TM.

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en que la proteasa es trombina, el factor Xa,

ADAM17, la proteasa similar a tripsina de las vías respiratorias humanas (HAT), ACE (peptidildipeptidasa A), elastasa, furina, granzima, caspasa, preferentemente una de las caspasas 1-1, una metaloproteasa matricial (MMP), una TACE, una adamalisina, una serralisina, una astacina, el factor de coagulación Vlla, el factor de coagulación IXa, el factor de coagulación Xla, el factor de coagulación Xlla, calicreína, la proteína C o la proteasa de 3 serina asociada a MBP.

3. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la proteasa no citotóxica comprende una cadena L de una neurotoxina clostridial o un fragmento de la misma que es capaz de escindir una proteína SNARE; o en que la proteasa no citotóxica comprende una proteasa de IgA o un fragmento de

la misma que es capaz de escindir una proteína SNARE.

4. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en que el polipéptido comprende al menos un primer sitio de escisión destructivo presente en el componente proteásico no citotóxico y/o al menos un primer sitio de escisión destructivo presente en el dominio de translocación.

5. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que el dominio de translocación comprende un dominio de translocación de una neurotoxina clostridial.

6. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que la TM 45 comprende un dominio He o Hcc de una neurotoxina clostridial o un fragmento del mismo que es capaz de unirse a

una célula neuronal; o en que la TM comprende un péptido seleccionado de entre una hormona similar al glucagón, una neurohormona, una citocina neurroreguladora, una neurotrofina, un factor de crecimiento, una molécula señalizadora para la guía de axones, una proteína de unión a azúcares, un ligando que se une selectivamente a neurexina, un ligando para neurexina 2a, un ligando para neurexina 2(3, un ligando para neurexina 3a, un ligando 5 para neurexina 3(3, una WNT, Ng-CAM(LI), NCAM, N-cadherina, un péptido PACAP tal como un péptido VIP, agrina- MUSK, un polipéptido de la membrana basal y una variante de cualquiera de los polipéptidos anteriores; una citocina neurorreguladora tal como el factor neurotrófico ciliar (CNTF), una glicoforina A (GPA), un factor inhibidor de la leucemia (LIF), una interleucina (IL), una onostatina M, una cardiotropina 1 (CT-1), una citocina similar a cardiotropina (CLC), una neuroleucina, VEGF, un factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), un factor de 55 crecimiento epidérmico (EGF) y una variante de cualquiera de las citocinas neurorreguladoras anteriores.

7. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que después de la escisión en el sitio de escisión destructivo, el polipéptido tiene una capacidad reducida para escindir una proteína SNARE.

8. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones

precedentes.

9. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para uso en la supresión de una

afección o enfermedad seleccionada entre estrabismo, blefaroespasmo, bizqueo, distonía (por ejemplo, distonía espasmódica, distonía bucomandibular, distonía focal, distonía tardía, distonía laríngea, distonía de miembros), tortícolis (por ejemplo, tortícolis espasmódica), aplicaciones para tratamientos de belleza (cosmética) que se benefician de la ¡ncapacitación de células/músculos (a través de la regulación por disminución o inactivación de las 1 proteínas SNARE), un trastorno o afección neuromuscular de la motilidad ocular (por ejemplo, estrabismo concomitante, estrabismo vertical, parálisis del recto lateral, nistagmo, mlopatía distiroidea), calambre de los escribientes, blefaroespasmo, bruxismo, enfermedad de Wllson, temblores, tics, mloclonus segmentarlo; espasmos, espastlcldad debida a esclerosis múltiple crónica, espastlcidad que resulta en un control anormal de la vejiga, anismo, espasmo de la espalda, calambres musculares, dolores de cabeza tensionales, síndrome del músculo 15 elevador de la pelvis, espina bífida, discinesia tardía, enfermedad de Parklnson y tartamudeo.