Procedimiento para producir glucosidasa, composición enzimática y procedimiento de hidrólisis de biomasa.

Procedimiento para producir una β-glucosidasa mutante derivada de un termófilo que tiene fijada selectivamente a ella una cadena de azúcares y también tiene una actividad glucosidasa,

que comprende:

(i) preparar ADN que codifica una β-glucosidasa mutante derivada de un termófilo introduciendo una secuencia de ADN que codifica Asn-X-Ser o Asn-X-Thr (en las que, X es cualquier aminoácido excepto prolina) en ADN que codifica una β-glucosidasa derivada de un termófilo que está originalmente desprovista de una secuencia de glucosilación y, además, añadiendo una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal de secreción al ADN que codifica una β-glucosidasa mutante,

(ii) introducir el ADN que codifica una β-glucosidasa mutante al que se le ha añadido la secuencia de ADN que codifica la secuencia señal de secreción en un microorganismo eucariota, de modo que una β-glucosidasa mutante codificada por el ADN de la β-glucosidasa mutante se exprese como una proteína secretora, y

(iii) aislar y purificar la β-glucosidasa mutante expresada de este modo como una proteína secretora.

breve de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 muestra un alineamiento de una [3-glucosidasa derivada de Pyrococcus /uñosos (PfuBGL) mostrada en SEQ ID NO: 4, una p-glucosidasa derivada de Tn'cñodenna reese/ (TriReBGL) mostrada en SEQ ID NO: 1 y una [3-glucosidasa derivada de Asperg/Z/us n/ger (AspNgBGL) mostrada en SEQ ID NO: 2 en el ejemplo 1. La secuencia de glucosilación en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 estaba subrayada, y el sitio de introducción de la secuencia de glucosilación (H60, L61 y Y62) en SEQ ID NO: 4 estaba subrayada de forma similar.

[Figura 2-1] La figura 2-1 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (gPfuBGL) y las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (ThAggBGY), SEQ ID NO: 10 (CmGHFP), SEQ ID NO: 12 (SaBGAL), SEQ ID NO: 14 (SsoBGAL), SEQ NO: 16 (PtBGAL), SEQ ID NO: 18 (TvBGAL) y SEQ ID NO: 20 (FnGHFP) en el ejemplo 2. La secuencia de glucosilación Asn-Arg-Thr (N-R-T) insertada en la secuencia de SEQ ID NO: 6 estaba subrayada. Además, el sitio correspondiente al sitio de glucosilación Asn-Arg-Thr (N-R-T) en la secuencia de SEQ ID NO: 6 en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20 estaba subrayado de forma similar.

[Figura 2-2] La figura 2-2 es una continuación de la figura 2-1.

[Figura 3] La figura 3 es un diagrama que muestra el patrón de bandas de electroforesis en gel de poliacrilamida para PfuBGL (izquierda) preparada en el ejemplo comparativo 1 y la PfuBGL mutante glucosilada preparada en el ejemplo 2 sin tratamiento con EndoH (derecha) y con tratamiento con EndoH (centro). Se confirma una reducción del peso molecular de la PfuBGL mutante glucosilada mediante tratamiento con EndoH.

[Figura 4] La figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la cantidad de glucosa producida por degradación de celobiosa mediante PfuBGL en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 4.

[Figura 5] La figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la cantidad de glucosa producida por degradación de celobiosa mediante la PfuBGL mutante glucosilada en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 4.

[Figura 6] La figura 6 es un gráfico que muestra los resultados de la comparación de los cambios de la cantidad de glucosa producida entre el caso en el que a una composición enzimàtica que contenía una ceiuiasa derivada del género Tn'cñoc/erma + la PfuBGL mutante glucosilada se le permitió actuar sobre el sustrato de Iignoceiuiosa y el caso en el que a una composición enzimàtica que contenía una ceiuiasa derivada del género 7r/c/ioc/erma + PfuBGL se le permitió actuar sobre el sustrato de Iignoceiuiosa en el ejemplo 5. Como sustrato, se utilizó Iignoceiuiosa al 5% en peso, y se dejó proseguir a las reacciones hasta 28 horas a 50°C, y el producto de reacción se muestreó según era apropiado y se midió para conocer la concentración de glucosa. Se añadió ceiuiasa a 0,5 mg/ml y se añadió giucosidasa a 0,005 mg/ml (1/100 de la cantidad de ceiuiasa).

[Figura 7] La figura 7 es un diagrama que muestra la estructura básica de una cadena de azúcares unida a N. En la estructura básica de una cadena de azúcares unida a N, dos residuos de N-acetilglucosamina y, además, tres residuos de manosa están unidos a la cadena lateral de Asn de una giucosidasa derivada de un termófiio.

[Figura 8] La figura 8 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de AggBGY (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12.

[Figura 9] La figura 9 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de la AggBGY mutante glucosilada (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12. [Figura 10] La figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de CmGHFP (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12.

[Figura 11] La figura 11 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de la CmGHFP mutante glucosilada (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12. [Figura 12] La figura 12 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de SaBGAL (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12.

[Figura 13] La figura 13 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de la SaBGAL mutante glucosilada (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12. [Figura 14] La figura 14 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de SsoBGAL (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12.

[Figura 15] La figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de la SsoBGAL mutante glucosilada (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12. [Figura 16] La figura 16 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de PtBGAL (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12.

[Figura 17] La figura 17 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de la PtBGAL mutante glucosilada (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12. [Figura 18] La figura 18 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de TvBGAL (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12.

[Figura 19] La figura 19 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de la TvBGAL mutante glucosilada (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12. [Figura 20] La figura 20 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de FnGHFP (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12.

[Figura 21] La figura 21 es un gráfico que muestra los resultados de la evaluación de estabilidad térmica de la enzima midiendo los cambios de la actividad residual de la FnGHFP mutante glucosilada (valor relativo a 0 horas de calentamiento) en degradación de celobiosa en un tiempo de retención de calor de 50 a 90°C en el ejemplo 12.

Descripción de realizaciones

A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle.

La "glucosidasa" en la presente invención se refiere a una enzima que tiene una actividad de hidrolizar un disacárido que tiene un enlace [3-glucos:d¡co (es decir, la actividad p-glucosidasa). Aunque un grupo de enzimas pertenecientes a p-glucosidasa se enumera en la comisión enzimàtica (Enzyme Comm/ss/on) (EC) No: EC 3.2.1.21, una proteina que no pertenece a p-glucosidasa en términos de número de la EC pero que tiene la actividad P-glucosidasa mencionada anteriormente, también está abarcada por glucosidasa en la presente invención.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir una [5-giucosidasa mutante derivada de un termófiio que tiene fijada seiectivamente a eiia una cadena de azúcares y también tiene una actividad giucosidasa, que comprende:

(i) preparar ADN que codifica una [5-giucosidasa mutante derivada de un termófiio introduciendo una secuencia de ADN que codifica Asn-X-Ser o Asn-X-Thr (en !as que, X es cuaiquier aminoácido excepto proiina) en ADN que codifica una [t-glucosidasa derivada de un termófiio que está originaimente desprovista de una secuencia de giucosiiación y, además, añadiendo una secuencia de ADN que codifica una secuencia señai de secreción ai ADN que codifica una [t-glucosidasa mutante,

(¡i) introducir ei ADN que codifica una p-giucosidasa mutante ai que se ie ha añadido ia secuencia de ADN que codifica ia secuencia señai de secreción en un microorganismo eucariota, de modo que una p-giucosidasa mutante codificada por ei ADN de ia p-giucosidasa mutante se exprese como una proteina secretora, y (i¡¡) aisiar y purificar ia [t-glucosidasa mutante expresada de este modo como una proteina secretora.

2. Procedimiento para producir una [5-giucosidasa mutante, según ia reivindicación 1, en ei que ia cadena de azúcares es una cadena de azúcares de tipo rica en manosa.

3. Procedimiento para producir una [5-giucosidasa mutante, según ia reivindicación 1 ó 2, en ei que ia p-giucosidasa derivada de un termófiio es una P-giucosidasa deñvada de un termófiio seieccionado entre ei grupo que comprende ei género Su/ofo/oóus, ei género 77iem?op/asma, ei género Ca/d/v/rgra, ei género 77iermosp/iaera, ei género Pyrococcus, ei género P/cropMus, ei género Ca/d/v/rgra y ei género Ferv/dobacíer/um.

4. Procedimiento para producir una p-giucosidasa mutante, según una cuaiquiera de ias reivindicaciones 1 a 3, en ei que ia p-giucosidasa deñvada de un termófiio es una proteina que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos ¡guai que cuaiquiera de ias secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ iD NO: 4, SEQ iD NO: 8, SEQ iD NO: 10, SEQ iD NO: 12, SEQ iD NO: 14, SEQ iD NO: 16, SEQ iD NO: 18 y SEQ

ID NO: 20, o

(¡i) una secuencia de aminoácidos que tiene ei 85% o más de identidad con cuaiquiera de ias secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ iD NO: 4, SEQ iD NO: 8, SEQ iD NO: 10, SEQ iD NO: 12, SEQ iD NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ )D NO: 18 y SEQ iD NO: 20, y también una actividad p-giucosidasa.

5. Procedimiento para producir una p-giucosidasa mutante, según una cuaiquiera de ias reivindicaciones 1 a 4, en ei que el microorganismo eucariota es P/cñ/a pastor/s.

6. Procedimiento para producir una p-giucosidasa mutante, según una cuaiquiera de ias reivindicaciones 1 a 5, en ei que la secuencia señal de secreción es una secuencia señai de secreción de factor a.

7. Procedimiento para producir una p-giucosidasa mutante, según una cuaiquiera de ias reivindicaciones 1 a 6, en ei que la p-glucosidasa mutante derivada de un termófiio comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 6, SEQ iD NO: 38, SEQ iD NO: 40, SEQ iD NO: 42, SEQ iD NO: 44, SEQ iD NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ iD NO: 52, SEQ iD NO: 54 y SEQ iD NO: 56.

8. Composición enzimàtica para sacarificación de biomasa que comprende ceiuiasa y ia p-giucosidasa mutante derivada de un termófiio obtenida mediante ei procedimiento de producción, según una cuaiquiera de ias

reivindicaciones 1 a 7.

9. Composición enzimàtica para sacarificación de biomasa, según ia reivindicación 8, en ia que ia ceiuiasa es una mezcla de celulasas deñvadas de hongos fiiamentosos.

10. Composición enzimàtica para sacarificación de biomasa, según ia reivindicación 8 ó 9, en ia que ia mezcia de celuiasas derivadas de hongos fiiamentosos es una mezcia de ceiuiasas derivadas dei género 7r/c/ioderma.

11. Procedimiento para hidroiizar biomasa, que comprende utiiizar ia composición enzimàtica, según una cuaiquiera de ias reivindicaciones 8 a 10.

12. Procedimiento para hidroiizar biomasa, según ia reivindicación 11, que comprende fiitrar un hidroiizado obtenido por ia composición enzimàtica a través de una membrana de uitrafiitración, y separar y recuperar ia composición enzimàtica utìiìzada.