Procedimiento de producción de VWF maduro a partir del propéptido de VWF.

Un procedimiento de producción de Factor de von Willebrand (VWF) maduro a partir del propéptido de Factor de von Willebrand que comprende las etapas de:



(a) inmovilizar el propéptido de VWF en una resina de intercambio aniónico,

(b) incubar el propéptido de VWF inmovilizado con furina que comprende una actividad de al menos 0,2 Unidades de furina/Unidad de antígeno de VWF (Ag) para obtener VWF maduro inmovilizado, y

(c) aislar al menos el 90 % del VWF maduro de la resina de intercambio aniónico mediante elución.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/006291.

Solicitante: BAXTER INTERNATIONAL INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: ONE BAXTER PARKWAY DEERFIELD, IL 60015 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MUNDT, WOLFGANG, MITTERER, ARTUR, HASSLACHER, MEINHARD, MAYER,CHRISTA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/435 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de animales; de humanos.

PDF original: ES-2539284_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento de producción de VWF maduro a partir del propéptido de VWF

Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos de producción de Factor de von Willebrand maduro a partir del propéptido del Factor de von Willebrand.

Descripción de la técnica relacionada En el curso de la maduración de las proteínas dentro de una célula, la proteína a madurar experimenta modificaciones postraduccionales. Estas modificaciones incluyen, entre otras, acetilación, metilación, glucosilación y escisión proteolítica. Estas modificaciones son, en muchos casos, necesarias para la función y la actividad de la proteína y también pueden influir en la eficacia de las proteínas, en particular de las enzimas.

Las proproteínas (o precursores de proteínas) son proteínas inactivas que se convierten en una forma activa mediante una o más de estas modificaciones postraduccionales, en particular mediante la escisión de un propéptido de la proproteína. Los ejemplos de proproteínas incluyen, por ejemplo, proinsulina, protrombina, etc.

La producción de proteínas activadas es de gran importancia clínica y diagnóstica. Por ejemplo, pueden usarse proteínas activadas o maduradas para controlar la coagulación sanguínea.

Las proteínas activas están habitualmente disponibles en cantidades muy bajas en organismos vivos. Por lo tanto, sus proproteínas y proenzimas se activan preferentemente in vitro poniéndolas en contacto con enzimas activadoras (por ejemplo, proteasas) .

Los procedimientos actuales de producción de proteínas maduras a partir de proproteínas usan proteasas inmovilizadas o se realizan en solución libre. Ambos procedimientos tienen desventajas. Entre estas está el requerimiento de que la proteasa se inmovilice después del procesamiento.

El factor de Von Willebrand (VWF) es una glucoproteína que circula en el plasma como una serie de multímeros cuyo tamaño varía de aproximadamente 500 a 20.000 kD. Las formas multiméricas del VWF están compuestas de subunidades de 250 kD que se unen entre sí mediante puentes disulfuro. El VWF media la adhesión inicial de plaquetas al subendotelio de la pared de los vasos dañados; se cree que únicamente los multímeros más grandes muestran también actividad hemostática. Los multímeros que tienen masas moleculares grandes están almacenados en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales y se liberan tras la estimulación. El VWF liberado se procesa entonces adicionalmente por las proteasas del plasma para dar como resultado formas de VWF de bajo peso molecular.

El VWF se sintetiza por las células endoteliales y los megacariocitos como un pre-propéptido de VWF ("pp-VWF") que consiste en una larga extensión de dominios repetidos. Después de la escisión del péptido señal, el propéptido de VWF dimeriza a través de enlaces disulfuro en su región C-terminal. Los dímeros sirven como protómeros para la multimerización, que está dirigida por enlaces disulfuro entre los extremos terminales libres. El ensamblaje hasta multímeros está seguido por la eliminación proteolítica del propéptido (Leyte y col., Biochem. J. 274 (1991) , 257-261.

Se ha postulado que el papel fisiológico del propéptido de VWF yace en la dirección del ensamblaje de los multímeros de VWF, bien antes o después de la escisión de las moléculas del propéptido de VWF. (Takagi y col., JBC 264 (18) (1989) , 10425-10430. Mientras que la eliminación del propéptido es casi completa en seres humanos, este procedimiento no es muy eficaz en el caso de niveles muy altos de expresión recombinante de VWF en líneas celulares de mamíferos. Los sobrenadantes de los cultivos celulares de dichas líneas celulares modificadas generalmente comprenden una mezcla de VWF maduro y precursores de VWF como el propéptido de VWF. Con el fin de obtener el VWF maduro es, por lo tanto, necesario convertir los precursores de VWF, en particular el propéptido de VWF, en VWF maduro. En el documento EP 0 775 750 A, por ejemplo, esta maduración se alcanza usando furina. En particular, en el documento EP 0 775 750 A se sugiere la co-expresión de furina y VWF recombinantemente de modo que pueda ocurrir la maduración de VWF in situ. En el documento WO 00/49047 se describe un procedimiento de producción de VWF maduro usando trombina, en el que se realiza la maduración en solución o usando trombina unida a un soporte sólido.

Sumario de la invención Un primer aspecto de la invención proporciona un procedimiento de producción de Factor de von Willebrand Maduro (VWF) a partir del propéptido del Factor de von Willebrand que comprende las etapas de:

(a) inmovilizar el propéptido de VWF en una resina de intercambio aniónico,

(b) incubar el propéptido VWF inmovilizado con furina que comprende una actividad de al menos 0, 2 Unidades de furina/Unidad de antígeno (Ag) de VWF para obtener VWF maduro inmovilizado, y

(c) aislar al menos el 90 % del VWF maduro de la resina de intercambio aniónico mediante elución.

La presente invención proporciona un procedimiento eficaz para producir Factores de von Willebrand (VWF) maduros a partir del propéptido de VWF. La presente invención proporciona un nuevo procedimiento para producir VWF maduro mediante la inmovilización del propéptido de VWF en una resina de intercambio iónico, seguida por la maduración del propéptido de VWF unido con furina y la elución del VWF madurado de la resina de intercambio iónico. El procedimiento de la presente invención es particularmente adecuado para la maduración in vitro del VWF a partir del propéptido de VWF. Este procedimiento permite la producción de VWF maduro con una actividad específica y pureza alta.

Breve descripción de los dibujos La Fig.1 muestra la dependencia del Ca2+ de la actividad de la furina. La Fig.2 muestra la dependencia de la eficacia de maduración de la concentración de VWF. Se disolvieron 5 ml de VWF en tampón de resolubilización (citrato 100 mM, HEPES 100 mM, ph=7, 0) , se enriquecieron con 5 Unidades de furina/U de VWF y se incubaron durante 22 h a 37 °C. Se analizaron las muestras mediante SDS-PAGE en geles al 8% y se visualizaron los péptidos separados mediante tinción de plata.

línea 1: 1 U/ml de VWF + 5 U/U de furina 0 h línea 2: 5 U/ml de VWF + 5 U/U de furina 0 h línea 3: 10 U/ml de VWF + 5 U/U de furina 0 h línea 4: 1 U/ml de VWF + 5 U/U de furina 6 h línea 5: 5 U/ml de VWF + 5 U/U de furina 6 h línea 6: 10 U/ml de VWF + 5 U/U de furina 6 h línea 7: 1 U/ml de VWF + 5 U/U de furina 24 h línea 8: 5 U/ml de VWF + 5 U/U de furina 24 h línea 9: 10 U/ml de VWF + 5 U/U de furina 24 h

La Fig.3 muestra la dependencia de la eficacia de maduración de la concentración de VWF. Se disolvieron 5 ml de VWF en tampón de resolubilización (citrato 100 mM, HEPES 100 mM, ph=7, 0) , se enriquecieron con 0, 4-0, 5 Unidades de furina/U de VWF y se incubaron a 37 °C. Se recogieron las muestras a T = 0, 20 y 24 horas. Se analizaron las muestras mediante SDS-PAGE en geles al 8 % y los polipéptidos separados se visualizaron mediante tinción de plata.

línea 1: 10 U/ml de VWF línea 2: VWF + 0, 5 U/U de furina 0 h línea 3: VWF + 1 U/U de furina 0 h línea 4: VWF + 2 U/U de furina 0 h línea 5: VWF + 2, 5 U/U de furina 0 h línea 6: VWF + 4 U/U de furina 0 h líneas de 7-11: como anteriormente, 20 h líneas de 12-16: como anteriormente, 24 h.

La Fig.4 muestra los eluatos del TMAE después de la maduración en columna. El flujo de MAB a través del material que contenía VWF/propéptido de VWF se bombeó en la columna a aproximadamente 180 -220 Unidades de Ag de VWF/ml de resina y propéptido de VWF A /VWF antes de la maduración 1 CR38-E1+E2 (2, 4 U de furina/U de VWF; 3 h a 37°C; FUR24_04_UFK_02; gradiente de elución 2 CR30-E1 + E2 (3, 2 U de furina/U de VWF; 1 h a 37°C; FUR_UF06_01 (clon 488-3) ; gradiente de elución 3 CR36-E, (7, 8 U de furina/U de VWF; 4 h a 37°C; FUR_015 (pre-purificado en TMAE) , etapa de elución 4 CR37-E, (5, 8 U de furina/U de VWF; 8 h a 4°C; FUR_UF06_01 (clon 488-3) , lote de elución 5 CR38-E1+E2 (4, 8 U de furina/U de VWF; 8 h a 4°C; FUR_018 (pre-purificado en TMAE) , gradiente de elución Descripción detallada de la invención El procedimiento de la presente invención es particularmente adecuado para la maduración in vitro del VWF a partir de su forma de propéptido de VWF. Los procedimientos convencionales actuales producen VWF maduro bien incubando su forma de propéptido con proteasas en una fase líquida, por lo que la maduración en sí misma (es decir, la escisión del propéptido a partir de la proteína) ocurre en un estado no unido en solución libre, o tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/49047, inmovilizando la proteasa en un transportador... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de producción de Factor de von Willebrand (VWF) maduro a partir del propéptido de Factor de von Willebrand que comprende las etapas de:

(a) inmovilizar el propéptido de VWF en una resina de intercambio aniónico,

(b) incubar el propéptido de VWF inmovilizado con furina que comprende una actividad de al menos 0, 2 Unidades de furina/Unidad de antígeno de VWF (Ag) para obtener VWF maduro inmovilizado, y

(c) aislar al menos el 90 % del VWF maduro de la resina de intercambio aniónico mediante elución.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho propéptido de VWF es de origen recombinante.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha resina de intercambio aniónico comprende grupos trimetilaminoetilo (TMAE) .

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha resina de intercambio aniónico está empaquetada en una columna cromatográfica.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el propéptido de VWF es inmovilizado en la resina de intercambio aniónico y es incubado con furina a una conductividad medida a 25 ºC inferior a 25 mS/cm, tal como inferior a 20 mS/cm, tal como inferior a 16 mS/cm.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho VWF maduro es eluido de la resina de intercambio aniónico a una conductividad medida a 25 ºC de al menos 40 mS/cm, tal como al menos 60 mS/cm, tal como al menos 80 mS/cm.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha furina está comprendida en una solución, que comprende CaCl2 adicional a una concentración de 0, 01 a 10 mM, tal como de 0, 1a 5 mM, tal como de 0, 1a 2 mM.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la incubación se realiza desde 1 min hasta 48 horas, tal como desde 10 min hasta 42 horas, tal como desde 20 min hasta 36 horas, tal como desde 30 min hasta 24 horas.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la incubación se realiza a una temperatura de 2 a 40 ºC, tal como de 4 a37ºC.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha furina es de origen recombinante.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la furina tiene una actividad de al menos 0, 5 Unidades de furina/Unidad de VWF (Ag) .

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la furina comprende una actividad de 0, 5-4, 0 Unidades de furina/Unidad de VWF (Ag) .

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el VWF maduro es al menos el 95 % de VWF maduro, tal como al menos el 98 % de VWF maduro, tal como al menos el 99 % de VWF maduro.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la incubación se lleva a cabo a 2-8 ºC o a 37 ºC.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 13, en el que se incuban una media de 0, 9 Unidades de furina/Unidad de VWF (Ag) durante al menos 4 horas.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la furina tiene una actividad de al menos 0, 2-2, 0 Unidades de furina/Unidad de VWF (Ag) , opcionalmente durante un periodo de 4 horas.

 

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