Proceso para la obtención de monosialogangliósido GM1 puro para su uso médico.

Un proceso para el aislamiento y la purificación de monosialogangliosido GM1 que consta de la separación del monosialogangliosido GM1 desde Fucosyl-GM1 en un mezcla lipídica que contiene el monosialogangliosido GM1 como el componente gangliósido principal mediante la cromatografía de columna de intercambio iónico utilizando un eluyente que comprende iones potasio o de cesio.

Proceso para la obtención de monosialogangliósido GM1 puro para su uso médico

La presente invención se refiere al monosiagangliosido GM1 y más especialmente a los procesos para la obtención y la purificación del monosialogangliosido GM1.

ANTECEDENTES

Los gangliósidos son una clase de glicoesfingolípidos, que tienen uno o más residuos de ácido siálico y que son encontrados de manera abundante en el tejido cerebral y nervioso de los seres humanos y de los animales. El monosialogangliosido GM1 es conocido por un número de aplicaciones farmacéuticas, especialmente en la reparación y tratamiento de los trastornos de los sistemas nerviosos central y periférico.

Los gangliósidos son convenientemente extraídos del tejido cerebral bovino o porcino, de acuerdo con el documento de patente US 4.849.413. Con la finalidad de que sea adecuado para aplicaciones farmacéuticas, el monosialogangliosido GM1 debe ser entonces aislado y purificado.

Es conocido el tratar las mezclas extraídas de lípidos mediante métodos químicos o enzimáticos con el fin de transformar otros componentes gangliósidos del monosiagangliosido GM1 1, con la finalidad de aumentar la producción de monosialogangliosido GM1. Tales métodos incluyen la hidrólisis ácida con un ácido débil, tal y como se describe en el documento de patente CN 1353112 o hidrólisis enzimática usando un sialidasa, por ejemplo tal y como está descrito además en el documento de patente US 5.296.360.

La purificación adicional de tal mezcla lipídica mejorada GM1 por cromatografía de exclusión, utilizando un eluyente de cloroformo: metanol: agua 60:30:4.5 está descrita en el documento de patente EP 0 150 712. El documento de patente EP 0 489 352 describe la purificación de una mezcla lipídica mejorada GM1 mediante la ultrafiltración de una solución de la mezcla lipídica con alfa-ciclo-dextrina, seguida de la extracción de GM1 por extracción por solventes con etanol. Está divulgado que puede obtenerse GM1 con una pureza del 95%.

Ha sido previamente demostrado que tales procesos tienen desventajas con respecto a la pureza y al rendimiento de GM1 y con respecto al costo, la eficiencia y la efectividad cuando son aplicados a una escala industrial.

Para las aplicaciones farmacéuticas es requerido producir el gangliósido GM1 con una pureza alta. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad permanente de procesos con el fin de obtener el gangliósido GM1 de pureza alta.

Los inventores de la presente solicitud han encontrado sorprendentemente que el gangliósido GM1 puede ser separado efectivamente de otros gangliósidos mediante un proceso basado en la cromatografía de intercambio iónico.

De acuerdo con la presente invención ha sido encontrado que el gangliósido GM1 puede ser preparado en pureza alta mediante un proceso en donde el GM1 es separado de Fucosyl-GM1 en una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliosido GM1 como el principal componente gangliósido por una cromatografía de columna de intercambio iónico utilizando un eluyente que comprende iones de potasio o de cesio.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un proceso para el aislamiento y la purificación del gangliósido GM1 de acuerdo con la reivindicación 1.

De acuerdo con una realización preferente de la presente invención se proporciona un proceso que comprende de manera general los pasos de:

(a) la separación de GM1 del Fucosyl-GM1 en una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliosido GM1 como el componente gangliósido principal mediante la cromatografía de columna de intercambio iónico utilizando un eluyente que incluye iones de potasio o de cesio,

(b) la recuperación del soluto desde la solución eluyente,

(c) la diafiltración de una solución acuosa del soluto recuperado,

(d) la adición de una sal de sodio y la diafiltración de la solución resultante y

(e) la recuperación de GM1.

De forma ventajosa, el proceso de la presente invención permite la preparación del monogangliosido GM1 en pureza alta. De acuerdo con la presente invención el monosialogangliosido GM1 puede prepararse con una pureza superior al 98%, incluso superior al 99,0% e incluso 99,9%.

Además, el proceso de la presente invención utiliza de manera ventajosa unos pasos sencillos, es eficiente desde el punto de vista de costes y es adecuado para la aplicación a escala industrial.

Otros objetivos y ventajas de la presente invención serán evidentes de las reivindicaciones y de la siguiente descripción detallada y los ejemplos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención proporciona un proceso para la purificación del monogangliosido GM1, en donde el GM1 es separado de Fucosyl-GM1 en una mezcla lipídica que contiene monosialogangliosido GM1 como el componente gangliósido principal mediante la cromatografía de columna de intercambio iónico utilizando un eluyente que comprende iones de potasio o de cesio.

En una realización preferente es proporcionado un proceso para preparar monosialogangliosido GM1 de pureza alta que comprende los pasos de:

(a) la separación de GM1 desde Fucosyl-GM1 en un mezcla lipídica que contiene el monosialogangliosido GM1 como el componente gangliósido principal mediante la cromatografía de columna de intercambio iónico utilizando un eluyente que comprende iones de potasio o de cesio.

(b) la recuperación del soluto de la solución eluida del paso (a),

(c) la diafiltración de una solución acuosa del soluto recuperado del paso (b), con el fin de eliminar las sales residuales de potasio o de cesio,

(d) la adición de iones de sodio, preferentemente en la forma de una sal de sodio adecuada, con el fin de desplazar a los iones de potasio o de cesio ligados a GM1 y la diafiltración de la solución acuosa, con la intención de eliminar la sal de sodio residual y

(e) la recuperación de GM1, en la forma de su sal de sodio.

La mezcla lipídica puede ser preparada de un extracto crudo lípido de tejido cerebral bovino, ovino, equino o porcino.

De manera ventajosa la mezcla lipídica que contiene el monogangliosido GM1, como el componente gangliósido que prevalece puede prepararse de un extracto lípido que contiene por lo menos un 30%, preferiblemente por lo menos el 50% y más preferiblemente por lo menos el 70% de una mezcla de los gangllósldos. El extracto lípido restante puede estar generalmente compuesto de sulfátidos, cerebrósldos, ácidos grasos y proteínas.

El extracto lípido puede ser, de manera ventajosa, sometido en primer lugar a una diafiltración a través de una membrana que tiene un tamaño de poro de 10000 a 100000 Daltons, preferiblemente alrededor de 50000 Daltons, con la finalidad de desalar la solución. Para la diafiltración puede ser utilizada cualquier membrana de diálisis convencional. De forma ventajosa pueden ser utilizadas las cassettes de filtro, por ejemplo, los tipos de cassettes de polisulfona SARTOCON ® (Sartorius), por ejemplo con un límite de unos 50000 Daltons.

Preferentemente el extracto lipídlco es sujeto a un tratamiento mediante hidrólisis con el fin de transformar los otros componentes gangliósidos importantes, tales como GT1b, GD1a y GD1b, en GM1 con el fin de aumentar el contenido de GM1.

La hidrólisis puede ser llevada a cabo utilizando métodos convencionales. De forma ventajosa, la hidrólisis puede ser llevada a cabo usando cualquiera de los dos métodos generales para la hidrólisis de los gangliósidos conocidos en la literatura, conocidos como la hidrólisis áclda o la hidrólisis enzimática.

La hidrólisis ácida puede ser llevada a cabo, por ejemplo, utilizando un ácido mineral diluido, tal como el ácido clorhídrico diluido, el ácido sulfúrico y el ácido nítrico. La hidrólisis ácida puede ser efectuada ajustando el pH de una solución acuosa del extracto lípido a un pH entre 3,5 y 5, preferiblemente alrededor de pH 4,0 y calentar la solución a un temperatura preferiblemente entre 90° C y 100° C durante el tiempo necesario para completar la conversión de los otros grandes componentes gangliósidos a GM1. El tiempo necesario para hidrolizar los principales gangllósldos a GM1 depende de la temperatura y del pH elegidos. En general, cuanto más alto sea el pH será más largo el tiempo requerido para completar la hidrólisis y cuanto más alta sea la temperatura de reacción más corto será el tiempo requerido para completar la hidrólisis. La reacción de hidrólisis puede llevarse a cabo de manera general durante más de 2 a 5 horas. Por ejemplo, donde la hidrólisis se lleva a cabo con el pH a 4,0 y 95° C el tiempo requerido para completar la reacción de hidrólisis es de alrededor de 3 horas.

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1. Un proceso para el aislamiento y la purificación de monosialogangliosido GM1 que consta de la separación del monosialogangliosido GM1 desde Fucosyl-GM1 en un mezcla lipídica que contiene el monosialogangliosido GM1 como el componente gangliósido principal mediante la cromatografía de columna de intercambio iónico utilizando un eluyente que comprende iones potasio o de cesio.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además los pasos de:

(a) la recuperación desde la solución eluida,

(b) la diafiltración de una solución acuosa del soluto recuperado del paso (a),

(c) la adición de una sal de sodio y la diafiltración de la solución acuosa resultante,

(d) la recuperación de GM1 en la forma de su sal de sodio.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2 en donde el eluyente comprende potasio o acetato de cesio.

4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3 en donde el eluyente es una solución metanólica de potasio o acetato de cesio.

5. El proceso de acuerdo con alguna de las reivindicaciones precedentes en donde la columna de intercambio iónico contiene una resina que tiene un grupo amino cuaternario.

6. El proceso de acuerdo con alguna de las reivindicaciones precedentes en donde la columna de intercambio iónico en primer lugar es equilibrada con metanol.

7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2 en donde es adicionado NaCI en el paso (c).

8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2 en donde la diafiltración es llevada a cabo utilizando una membrana con un tamaño de poro de 10000 a 100000 Daltons.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2 en donde la recuperación de GM1 en el paso (d) consta del secado de la solución de permeado mediante el secado por aspersión o por secado al vacio con el fin de producir un polvo.

10. El proceso de acuerdo con alguna de las reivindicaciones precedentes que comprende un paso preliminar de purificación a la separación de GM1 por cromatografía de intercambio iónico, comprendiendo dicho paso de purificación:

(a) la diafiltración de una solución acuosa de una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliosido GM1 como el principal componente gangliósido a través de una membrana que tiene un tamaño de poro de 10000- 100000 Daltons,

(b) la concentración del permeado y la recuperación del soluto de la mezcla lipídica que incluye el GM1.

11. El proceso de acuerdo con alguna de las reivindicaciones precedentes en donde la mezcla lipídica que contiene el monosialogangliosido GM1 como el componente gangliósido principal es obtenida mediante la hidrólisis de un extracto lípido que contiene una mezcla de gangliósidos que tiene una pureza de por lo menos el 50%.

12. El proceso de acuerdo con alguna de las reivindicaciones precedentes en donde la hidrólisis es llevada a cabo mediante el tratamiento del extracto lípido con una sialidasa Arthrobacter ureafaciens cepa S o sialidasa Vibrio cholerae.