Procedimientos y composiciones para la producción de proteína recombinante en células de mamífero que expresan HBx.

Un procedimiento de producción de una proteína heteróloga en células huésped de mamífero en cultivo,

que comprende cultivar las células huésped de mamífero seleccionadas del grupo que consiste en células BHK21, en el que dichas células huésped de mamífero contienen un ácido nucleico que codifica HBx, un ácido nucleico que proporciona XBP1s exógena y un ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga, en condiciones tales que HBx y la proteína heteróloga se expresan por las células huésped de mamífero.

Procedimientos y composiciones para la producción de proteína recombinante en células de mamífero que expresan HBx.

Referencia a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reclama prioridad sobre la solicitud provisional de EE.UU. Nº 61/056.634, presentada el 28 de 5 mayo de 2008.

Listado de secuencias

La presente solicitud incluye una copia en papel y una copia electrónica de un listado de secuencias. Los solicitantes certifican que la materia sujeto contenida en la copia electrónica del listado de secuencias es la misma que la que se presenta en la copia en papel. 10

Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a composiciones y procedimientos para la producción de una proteína heteróloga mediante células huésped de mamífero recombinantes que expresan la proteína X del virus de la hepatitis B (HBx) .

Antecedentes de la invención 15

La necesidad de proteínas recombinantes, incluyendo proteínas terapéuticas, es aguda y existe una necesidad continua de mejorar la eficiencia de la producción de proteínas recombinantes. Aumentar el rendimiento de proteínas durante la producción comercial sigue siendo un reto significativo.

Se ha notificado que la transfección transitoria con el plásmido HBx puede producir la regulación por aumento de la expresión de la linfotoxina alfa heteróloga por las células de hepatoma Huh7 y Chang. Lee y col., Biochim Biophys 20 Acta 1741, 75 - 84 (2005) . Además, las células de hepatoma de Chang que se transfectan de forma estable con HBx pueden tener una expresión regulada por incremento de la linfotoxina alfa.

PARASHAR MISRA K Y COL., divulgan "The conserved amino-terminal region (amino acid 1 - 20) of the hepatitis B virus X protein shows a transrepression function", VIRUS RESEARCH, AMSTERDAM, NL, vol. 105, nº 2, (2004 - 10 - 01) , páginas 157 - 165. 25

También se ha notificado que, en las células en suspensión de hepatocarcinoma de mamífero, la transfección con HBx puede reducir los niveles de expresión de E-cadherina de un modo dependiente de la dosis. Lee y col., Oncogene 24, 6617 - 6625 (2005) .

Las proteínas secretadas y de membrana normalmente sufren plegamiento y otras modificaciones postraduccionales en el sistema retículo endoplasmático (RE) -aparato fe Golgi de las células huésped. La función de la ruta de 30 señalización de respuesta a la proteína no plegada (UPR) es detectar los niveles de proteína no plegada y ajustar el plegamiento proteico y la capacidad de secreción de las células a cambios ambientales, tales como el estrés del RE. Bernales y col., Annu. Rev. Cell Develop. Biology 22, 487 - 506 (2006) . El estrés del RE es una condición en la que la capacidad del RE para plegar proteínas se ha saturado. IRE1 (enzima 1 dependiente de inositol) y ATF6 (factor activador de la transcripción 6) son dos sensores principales de proteínas no plegadas dentro de las células y 35 actualmente se sabe que son transductores clave de la UPR. Credle y col., Proc Natl Acad Sci USA 102, 18773 - 18748 (2005) ; Nadanaka y col., Mol. Cell. Biology 27, 1027 - 1043 (2007) .

Estas rutas metabólicas se activan mediante una serie de genes víricos, incluyendo: a) glicoproteína de membrana de tipo 1 residente en el RE de 27 kDa del citomegalovirus humano, dentro de la región única 11 corta (US 11) , que está dirigida a las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) para el paso desde el RE 40 al citosol; b) proteína no estructural NS4B CODIFICADA POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC) , que interacciona físicamente con CREB-RP/ATF6ß y activa las rutas del ATF6 y la IRE1 induciendo el corte y empalme de XBP1. Zheng y col., J. Microbiology 43, 529 - 536 (2005) ; y c) proteína de 17 kDa del virus de la hepatitis B dentro del gen X del marco de lectura abierto (HBx) , que es un activador multifuncional de la transcripción que regula diversos acontecimientos celulares, tales como el ciclo celular, la supervivencia y la apoptosis. 45

IRE1, una exonucleasa endógena, puede modificar el ARNm de la proteína de unión a la caja X (XBP1) para formar ARNm de XBP1 sometido a corte y empalme (XBP1s) , que tiene como resultado un cambio de marco de la traducción, cuyo producto activa la secreción proteica aumentada a través de la vía UPR. Tigges y col., Metab. Eng. 8, 264 (2006) . Tigges y col., . divulgan adicionalmente la transfección de células con XBP1 y XBP1s para aumentar la capacidad secretora de la fabricación biofarmacéutica de terapéuticas a base de proteínas secretadas. Tigges y 50 col., . también enseñan que la transfección transitoria con el plásmido XBP1s y los genes que codifican la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (hSEAP) , el VEGF hormonal secretado o la -amilasa secretada puede dar lugar a la producción proteica de hSEAP, VEGF y -amilasa, respectivamente.

Las proteínas recombinantes se producen mediante diversas técnicas, incluido el cultivo de las células huésped sobre sustratos sólidos, en microvehículos suspendidos y, para células independientes de anclaje, en cultivo de suspensión no adherentes. Los cultivos adherentes incluyen cultivos en microvehículos que pueden mantenerse en suspensión. En un cultivo de suspensión de células independientes de anclaje, las células no se fijan a un sustrato sino que, en su lugar, se mantienen en suspensión en un medio que contiene nutrientes dentro de un vaso de 5 reacción adecuado.

Se usan varios procedimientos de suspensión para la producción y mantenimiento de células huésped concretas. Los procedimientos típicos de cultivos celulares en suspensión para microvehículos y para células independientes de anclaje usan agitadores, rodillos, agitadores o sistemas de elevación con aire que agitan un medio de cultivo celular y células en cultivo o en biorreactores. La aireación, la temperatura, la velocidad de agitación y condiciones 10 similares se pueden controlar y ajustar para proporcionar condiciones favorables al crecimiento del cultivo y la elevada producción de proteínas recombinantes.

Sumario de la invención

La invención aprovecha determinados hallazgos inesperados con respecto al uso de HBx para aumentar la producción de proteínas heterólogas (Recombinantes) mediante cultivos celulares de células de mamífero. En sus 15 diversas realizaciones, la invención proporciona procedimientos y composiciones para producir proteínas recombinantes mediante expresión de HBx en células huésped de mamífero que también expresan una proteína recombinante, de modo que la producción de la proteína recombinante se eleva en dichas células en relación con las células recombinantes comparables que no expresan HBx.

En una primera realización, la invención comprende un procedimiento de producción de una proteína heteróloga en 20 células huésped de mamífero, que comprende cultivar células huésped de mamífero seleccionadas del grupo que consiste en células HKB 11, células CHO-S, células BHK21, células C2C12 y células HEK293, en el que dichas células huésped de mamífero contienen un ácido nucleico que codifica HBx y un ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga, en condiciones tales que HBx y la proteína heteróloga se expresen en las células huésped de mamífero. 25

En una realización adicional, la invención comprende un procedimiento de producción de una proteína heteróloga en células huésped de mamífero que comprende cultivar células huésped de mamífero en cultivo de suspensión no adherente, en el que dichas células huésped de mamífero contienen un ácido nucleico que codifica HBx y un ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga, en condiciones tales que HBx y la proteína heteróloga se expresen en las células huésped de mamífero. 30

En una realización adicional, la invención comprende un procedimiento para producir una proteína heteróloga en células huésped de mamífero, que comprende a) proporcionar células huésped de mamífero que contienen ácido nucleico que codifica HBx y que contienen ácido nucleico que proporciona XBP1s exógena; y b) cultivar dichas células de mamífero en condiciones tales que HBx, XBP1s exógena y la proteína heteróloga se expresan en las células de mamífero. El efecto de la coexpresión de ácidos nucleicos que codifican HBx y XBP1s heteróloga puede 35 ser sinérgico.

En otra realización, la invención es una composición que comprende células huésped de mamífero que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga y un ácido nucleico que codifica HBx, en la que las células huésped de mamífero derivan de una línea celular seleccionada del grupo que consiste en células HKB11, células... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una proteína heteróloga en células huésped de mamífero en cultivo, que comprende cultivar las células huésped de mamífero seleccionadas del grupo que consiste en células BHK21, en el que dichas células huésped de mamífero contienen un ácido nucleico que codifica HBx, un ácido nucleico que proporciona XBP1s exógena y un ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga, en condiciones tales 5 que HBx y la proteína heteróloga se expresan por las células huésped de mamífero.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico que codifica HBx y el ácido nucleico que proporciona XBP1s se transfectan en las células huésped de mamífero y se expresan de forma transitoria.

3. El procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el cultivo comprende un medio de cultivo y la proteína heteróloga se secreta al medio de cultivo. 10

4. El procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende recuperar y purificar adicionalmente la proteína heteróloga.

5. El procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga se expresa de forma estable o transitoria por las células huésped de mamífero.