Preparación rápida y uso de tejidos y estructuras obtenidas por ingeniería tisular como implantes individuales.

Un método ex vivo para fabricar un implante individual obtenido por ingeniería de tejidos basado en una estructura de soporte natural o sintética como matriz para el crecimiento de células de tejido para la curación y remodelación sin cicatrices de tejido defectuoso o lesionado en un paciente por medio de células madre y células sanas obtenidas del paciente;

comprendiendo el método las etapas de:

(i) proporcionar una preparación de células madre no expandidas autólogas recién preparadas obtenidas de la sangre periférica o células de la médula ósea del paciente a tratar, en el que las células madre son estimuladas incubando la preparación de células madre con eritropoyetina (EPO),

(ii) proporcionar una preparación de células sanas como células de copia obtenidas mediante biopsia del tejido defectuoso o lesionado del paciente a tratar, e incubar la preparación de células sanas con la matriz de soporte, cargando de este modo las células sanas sobre o en la matriz de soporte,

(iii) incubar la matriz de soporte pretratada de la etapa (ii) con la preparación de células madre de la etapa (i) en presencia de una composición que comprende (a) un factor nativo que estimula células madre, en el que este factor es EPO, (b) un factor nativo que recluta células madre e incrementa la disponibilidad de células madre, en el que este factor es G-CSF o GM-CSF, y (c) un factor nativo que promueve la diferenciación de células madre, en el que este factor es TGF-β, VEGF, vitamina E o vitamina C, y

(iv) proporcionar la matriz de soporte tratada de este modo para implantación en el paciente por un cirujano, en el que las etapas (i) a (iv) se llevan a cabo en condiciones estériles en la cámara de un biorreactor o una cabina de flujo de aire laminar durante un periodo a 10 a 30 minutos y simultáneamente a la preparación del paciente para la implantación de la matriz de soporte, o están en conjunción temporal con cirugía del paciente.

Preparación rápida y uso de tejidos y estructuras obtenidas por ingeniería tisular como implantes individuales.

Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos, aparatos técnicos y composiciones para conseguir procesamiento a corto plazo para la fabricación de un injerto o trasplante "inteligente" en forma de una matriz de soporte que puede usarse para tratar o para curar lesiones y traumatismos de una gran diversidad de tejidos y órganos en una ubicación central o periférica del cuerpo humano o animal. La invención se refiere específicamente a regeneración tisular por medio de células madre y diferentes factores específicos que promueven la reparación tisular y orgánica que activan dichas células madre endógenas o exógenas para diferenciarse en células de tejido específico, reconstituyendo de este modo el microentorno original de la célula dañada por la lesión. La invención también se refiere a una escala temporal de procesamiento que es tan corta que puede realizarse en cuestión de minutos incluyendo la preparación, la integración, la activación y la determinación de células madre. Dependiendo del tamaño del defecto, las células madre se añadirán para defectos grandes pero también se reclutarán suficientemente a nivel local en defectos más pequeños. Una combinación de ambas opciones de reclutamiento de células es posible para garantizar la regeneración continuada durante un periodo de varias semanas dentro del cuerpo, hasta que se haya producido la completa restauración de la morfología y la función tisular.

En particular, la presente invención se refiere a un método novedoso capaz de iniciar un excelente proceso de preparación de células madre, que es tan corto que se aplica a un marco temporal de unos segundos a varios minutos.

El método se basa en el concepto de desencadenamiento extracorpóreo de la formación de un nicho que permite que las células madre sean guiadas para remodelación ex vivo / in vivo e in situ sin necesidad de ningún proceso de expansión o cultivo prolongado in vitro. Este novedoso método permite generar plantillas que se remodelarán espontáneamente en el tejido diana escogido una vez completados los procesos extracorpóreos. La invención está dirigida a casi todos los tipos de tejido humano o animal.

La invención también se refiere finalmente a composiciones y formulaciones o matrices de soporte revestidas con dichas composiciones que comprenden (i) preparaciones de células madre, (ii) eritropoyetina (EPO) y (ii) factores que promueven la diferenciación de células madre, (iv) factores que incrementan la disponibilidad de células madre, y opcionalmente (v) factores que están habitualmente presentes en el entorno de un traumatismo local.

La invención puede usarse para la preparación rápida y segura de injertos, trasplantes o implantes individuales obtenidos por ingeniería de tejidos, preferentemente en forma de una matriz de soporte para regeneración tisular rápida, de alta calidad y económica.

Antecedentes de la invención La ingeniería tisular de implantes es un proceso largo y arriesgado con respecto al mantenimiento de la esterilidad, que implica la obtención del células del donante, la transferencia de las células a un laboratorio y la manipulación de dichas células para iniciar su expansión y/o diferenciación. Después del periodo de expansión, las células se retiran frecuentemente de un sustrato de fijación temporal mediante, a saber, tripsinización, y seguidamente se transfieren a una matriz de soporte y se cultivan de nuevo sobre esta matriz de soporte. Este proceso, por lo tanto, a menudo requiere no solamente días sino semanas para ser eficaz.

La rápida y correcta fabricación de complejos injertos en 3D actualmente no es conocida en la técnica. Es fundamental y, de hecho, contradictoria con la enseñanza actual, que se centra en tecnologías celulares para expandir y diferenciar células para desencadenar la determinación in vitro y sembrándolas seguidamente sobre matrices de soporte o cultivarlas directamente sobre estas matrices de soporte. Se espera que esas células se diferencien in vitro. Este proceso a menudo requiere de media al menos 1-2 semanas o incluso más.

Una segunda línea de enseñanza usa métodos de inyección para células madre indiferenciadas de médula ósea o sangre, o médula ósea sin procesar como una forma de terapia celular de forma intraoperatoria directamente en un tejido que incluye, por ejemplo, el músculo cardiaco. Para la reparación de lesión medular, se cultivaron células para expandirse o a partir de fuentes específicas tales como la nariz o de origen embrionario. Esto último presenta el riesgo de entrar en transformación o formación de un tumor. Las células derivadas de la nariz representan un entorno bastante infeccioso para la recogida y no fueron clínicamente convincentes como solución genérica. Las células procedentes de médula ósea están siendo investigadas.

Una alternativa adicional es la regeneración tisular de novo. Se esperaba que el entorno local ayudara finalmente a diferenciar estas células. Examinando el entorno receptor más estrechamente, se ha descubierto que las células no se diferencian en, por ejemplo, células de músculo cardiaco después de inyección en el corazón. En estos casos, no se ha informado en absoluto sobre la formación de células musculares. En su lugar, se postuló un efecto bastante

positivo de la actividad secretora de las células madre trasplantadas para el apoyo de la recuperación. Los efectos en conjunto de dichos estudios fueron solamente una mejora de la función cardiaca del 4% . Esto significa que esta hipótesis del microentorno no consigue el objetivo de la formación tisular de novo, sino que tiene solamente un papel adyuvante.

En otro estudio, MSC expandidas se inyectaron después de la expansión in vitro en una matriz de soporte valvular acelularizada. Durante el cultivo in vitro, las células se sometieron a un proceso de selección que consiguió seleccionar células que tienen un prominente carácter de célula madre (replicación más intensa) y que pueden causar una inflamación reducida in vitro.

Hasta la fecha no está claro qué papel pueden desempeñar las citoquinas en este contexto. Sin embargo, es bien conocido de la técnica anterior que pueden usarse moléculas in vitro para controlar la pluripotencia y para inducir la diferenciación y determinación a un tejido específico.

La cicatrización de heridas está estrechamente vinculada a las respuestas inflamatorias. Después de la implantación quirúrgica de una tráquea artificial, la velocidad y calidad de cicatrización local, la supervivencia e integración es crucial para la asimilación del injerto y el éxito a largo plazo del implante.

Durante la inflamación, son liberadas citoquinas tales como IL-6, IL-1 y TNF que sostienen la respuesta inflamatoria. La inflamación, no obstante, puede ser una espada de doble filo, si la inflamación no finaliza a su debido tiempo debido a la remodelación insuficiente de la matriz de soporte del implante.

La remodelación de la matriz de soporte en ingeniería tisular se concibió como un proceso bastante desconocido y los mecanismos de activación eran desconocidos o clínicamente no viables. Convencionalmente, las células habrían sido sembradas en el material escogido y la integración en este material era un proceso que se atribuyó a un tiempo de expansión célula de forma ideal y penetración migratoria.

Fundamentalmente, existe un lado positivo de la inflamación que es un beneficio adicional para cicatrización que es necesario tener en consideración para la ingeniería de implantes biológicos.

La técnica anterior no proporciona la información adecuada sobre el control del microentorno después del trasplante del injerto para una remodelación sostenible, sobre la diferenciación de las células indiferenciadas después del trasplante, y, ni sobre las células madre que detectan las zonas de herida ni tampoco acerca de la diferenciación de las células trasplantadas después de expandirse in vitro para conseguir una auténtica curación sin cicatrices.

Dicha pre-expansión ha demostrado ser capaz de activar oncogenes. Esto es causado por la exposición a un entorno artificial y posible también a la repetición de ciclos de proliferación que no sustentan mecanismos de control normales de reparación y remodelación de heridas. Esta situación artificial, por supuesto, no es coherente con la capacidad del cuerpo para la regeneración después de heridas y lesiones. La activación de las células madre en el hombre y la determinación de células madre requieren un completo control de... [Seguir leyendo]

1. Un método ex vivo para fabricar un implante individual obtenido por ingeniería de tejidos basado en una estructura de soporte natural o sintética como matriz para el crecimiento de células de tejido para la curación y remodelación sin cicatrices de tejido defectuoso o lesionado en un paciente por medio de células madre y células sanas obtenidas del paciente; comprendiendo el método las etapas de:

(i) proporcionar una preparación de células madre no expandidas autólogas recién preparadas obtenidas de la sangre periférica o células de la médula ósea del paciente a tratar, en el que las células madre son estimuladas incubando la preparación de células madre con eritropoyetina (EPO) , (ii) proporcionar una preparación de células sanas como células de copia obtenidas mediante biopsia del tejido defectuoso o lesionado del paciente a tratar, e incubar la preparación de células sanas con la matriz de soporte, cargando de este modo las células sanas sobre o en la matriz de soporte, (iii) incubar la matriz de soporte pretratada de la etapa (ii) con la preparación de células madre de la etapa (i) en presencia de una composición que comprende (a) un factor nativo que estimula células madre, en el que este factor es EPO, (b) un factor nativo que recluta células madre e incrementa la disponibilidad de células madre, en el que este factor es G-CSF o GM-CSF, y (c) un factor nativo que promueve la diferenciación de células madre, en el que este factor es TGF-, VEGF, vitamina E o vitamina C, y (iv) proporcionar la matriz de soporte tratada de este modo para implantación en el paciente por un cirujano, en el que las etapas (i) a (iv) se llevan a cabo en condiciones estériles en la cámara de un biorreactor o una cabina de flujo de aire laminar durante un periodo a 10 a 30 minutos y simultáneamente a la preparación del paciente para la implantación de la matriz de soporte, o están en conjunción temporal con cirugía del paciente.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la preparación de células madre y/o la preparación de células sanas se pretrató incubando la preparación de células con una composición que comprende EPO, G-CSF y TGF-.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de incubación (iii) comprende la incubación con monocitos 30 autólogos procedentes de sangre periférica (PBMC) .

4. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los diferentes factores y/o diferentes células se proporcionan a la matriz de soporte mediante una formulación o composición viscosa similar a un gel o similar a un pegamento.

5. Un método de la reivindicación 4, en el que la formulación o la composición similar a un gel o similar a un pegamento se obtiene mediante polimerización después de la adición de Ca++ o trombina.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células madre son células madre positivas 40 para CD90.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la remodelación de tejido defectuoso o lesionado es u.

4. 50% más rápida respecto a los enfoques respectivos que no usan dichos factores de apoyo nativos.

8. Un implante individual obtenido por ingeniería de tejidos en base a una estructura de soporte natural o sintética que comprende células madre, células sanas de tejido lesionado o defectuoso de un paciente y factores nativos, en el que dicho implante está especificado y es obtenido mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso para la curación y remodelación sin cicatrices de tejido defectuoso o lesionado en un paciente en paralelo a un tratamiento médico u operatorio en curso en un proceso cercano al paciente o 50 intraoperatorio.

9. Un implante individual obtenido por ingeniería de tejidos para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que, después de la implantación, la matriz de soporte implantada es tratada con una composición similar a un gel o similar a un pegamento que comprende (i) una preparación de células madre autólogas no expandidas recién 55 preparadas (ii) un factor que estimula las células madre y acelera la remodelación de células de tejido, en el que dicho factor es EPO, (iii) un factor que recluta e incrementa la disponibilidad de células madre, en el que este factor es G-CSF o GM-CSF y (iv) un factor que promueve la diferencia de células madre o sus progenitoras, en el que este factor es TGF-, VEGF, vitamina C o vitamina E.