Procedimiento de preparación de biosensor amperométrico de lactato, biosensor obtenido mediante ese procedimiento y su uso en medios complejos.

Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico para la determinación de lactato basado en la enzima lactato oxidasa (LOD) que comprende las siguientes etapas:

dispersión de un biopolímero en disolvente orgánico; preparación de disolución mediadora añadiendo un mediador y nanotubos de carbono; preparación de disolución enzimática con al menos la enzima LOD; adición de la disolución mediadora y enzimática sobre una plataforma serigrafiada desechable; y secado del biosensor. También son objeto de la presente invención, el biosensor obtenido mediante este procedimiento, donde el biopolímero está basado en polisacáridos de glucosa y amilosa con grupos funcionales hidroxilo, amino, acetilo o carboxílicos y presenta enlaces glicosídicos; y su uso en medios complejos como medios celulares embrionarios, medios alimentarios o muestras de sangre.

Procedimiento de preparación de biosensor amperométrico de lactato, biosensor obtenido mediante ese procedimiento y su uso en medios complejos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se enmarca en el campo de los sensores amperométricos de uso en reproducción asistida, cuya finalidad más concretamente se centra en la detección y determinación de lactato/ácido láctico en medios complejos como los medios de cultivos 10 celulares, empleados en el desarrollo y crecimiento de células de embriones humanos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La mayoría de las investigaciones para el desarrollo de biosensores electroquímicos de lactato se centran en mejorar:

(i) la inmovilización de la enzima empleada sobre el material del electrodo,

(ii) la mejora de la transferencia electrónica, 20

(iii) el tipo de mediadores y coenzimas,

(iv) la mejora de la estabilidad del sensor, y

(v) la miniaturización del biosensor.

Teniendo en cuenta estas premisas, durante las últimas tres décadas han ido creciendo las 25 investigaciones sobre el desarrollo de biosensores de lactato debido a su importancia en distintas áreas de aplicación. En la mayoría de estudios que se pueden encontrar en la actualidad, se opta por la fabricación de biosensores amperométricos basados en dos tipos de enzimas: la lactato oxidasa y la lactato deshidrogenasa. Esta última requiere de la presencia del cofactor nicotinamida adenina dinucleótido oxidado (NAD+) que es reducido a 30 NADH, lo que conlleva la fabricación de un biosensor sofisticado, caro y con un tiempo de vida limitado [L. Agüí, M. Eguílaz, C. Peña-Farfal, P. Yáñez-Sedeño, J.M. Pingarrón, Electroanalysis 21 (2009) 386; A.C. Pereira, M.R. Aguiar, A. Kisner, D.V. Macedo, L.T. Kubota, Sensors and Actuators, B: Chemical 124 (2007) 269]. Por el contrario la enzima lactato oxidasa contiene el cofactor Flavín adenín dinucleótido (FAD) en su estructura, que 35 cataliza la conversión de lactato a piruvato en presencia de O2 generándose al mismo tiempo H2O2 como producto [V.P. Zanini, B. López De Mishima, V. Solís, Sensors and Actuators, B: Chemical 155 (2011) 75]. Por tanto y, debido fundamentalmente a que el cofactor NADH se encuentra presente en medios de cultivo embrionario, lo que interferiría en la medida si se utilizara un biosensor basado en la lactato deshidrogenasa, es necesario 40 desarrollar biosensores electroquímicos de lactato en los cuales sea empleada como enzima la lactato oxidasa.

Los biosensores amperométricos de lactato, que emplean lactato oxidasa como biocatalizador para la reacción de oxidación de lactato a piruvato generando peróxido de 45 hidrógeno, funcionan cuando se les somete a un potencial entre +0.5 y +0.65 V frente al electrodo de referencia AgCl/Ag (cloruro 3 M) . Este es el rango de potenciales necesario para oxidar el H2O2 sobre la superficie del electrodo y, por consiguiente, establecer una respuesta cuantificable que relaciona la intensidad de corriente obtenida con la cantidad de lactato presente en disolución de estudio [L. Rassaei, W. Olthuis, S. Tsujimura, E.J.R. 50 Sudhölter, A. Van Den Berg, Analytical and Bioanalytical Chemistr y 406 (2013) 123]. El problema de estos biosensores amperométricos de lactato es el elevado potencial al cual se debe realizar la medida cuando el medio en el que se encuentra el lactato puede contener a otras sustancias que también pueden contribuir a la lectura de la corriente registrable a estos potenciales (son los denominados interferentes) . Para evitar esta circunstancia, debemos encontrar un rango de potenciales dónde dichas sustancias no contribuyan a la lectura de corriente que sólo debe ser debida a la presencia del lactato. Por tanto, es necesario el desarrollo de biosensores amperométricos de lactato que puedan operar a 5 potenciales de trabajo del electrodo bajos y, consecuentemente, se puedan evitar interferencias debidas a esas especies electroactivas que pueden oxidarse a potenciales más elevados.

La estrategia elegida hasta el momento en la bibliografía relacionada es la búsqueda de 10 mediadores que favorezcan la disminución del potencial de oxidación del H2O2 producido por la especie enzima lactato oxidasa. De esta forma el proceso de oxidación no se lleva a cabo directamente sobre la superficie del sensor sino a través de un mediador anclado a ésta y ello se produce a un potencial sensiblemente inferior al descrito habitualmente [

Costa Eric D

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( 2 )

( 3 )

El grupo de Fábregas y Pérez [S. Pérez, E. Fàbregas, Analyst 137 (2012) 3854] inmovilizan simultáneamente la enzima lactato oxidasa junto con la enzima peroxidasa de rábano silvestre (HRP) . En este sistema bienzimático la oxidación de lactato está catalizada por la enzima lactato oxidasa dando como subproducto peróxido de hidrógeno que posteriormente se reduce a H2O por la acción catalítica de la enzima HRP en su forma reducida, dando 35 lugar a la enzima HRP en su forma oxidada. Finalmente, la enzima HRP en su forma oxidada se reduce por el FcMe dando lugar a la especie ferrocinio metanol (FcMe+) , que posteriormente se reduce electroquímicamente a un potencial de -200 mV frente a un electrodo pseudoreferencia de pasta de plata / cloruro de plata.

Por otra parte y para que estos sistemas puedan funcionar correctamente, es necesario inmovilizar la enzima LOD sobre la superficie del biosensor. Entre los distintos procedimientos referenciados algunos autores apuestan por el empleo de matrices de sol-gel [J. Huang, J. Li, Y. Yang, X. Wang, B. Wu, J.i. Anzai, T. Osa, Q. Chen, Materials Science and Engineering C 28 (2008) 1070; J. Weber, A. Kumar, S. Bhansali, Sensors and Actuators, 45 B: Chemical 117 (2006) 308] por ser inertes químicamente, por la posibilidad de modificar la porosidad y por permitir trabajar a bajas temperaturas. Un ejemplo de lo anterior es el biosensor fabricado por Huang y colaboradores, quienes emplearon una matriz de sílice sol-gel mediante la mezcla de Tetraetil ortosilicato (TEOS) , H2O y HCl que adicionaron sobre un electrodo de carbón vítreo modificado con nanotubos de carbón de pared múltiple (MWCNT) 50

y nanopartículas de platino, obteniendo un biosensor para la medida de muestras de sangre con una sensibilidad de 6.36 A/mM, un rango de linealidad de (0.2~2) x 10-3 M, pero con una estabilidad de 4 semanas [J. Huang, J. Li, Y. Yang, X. Wang, B. Wu, J.i. Anzai, T. Osa, Q. Chen, Materials Science and Engineering C 28 (2008) 1070].

Otros autores han preferido como sustrato la combinación de una matriz de sílice y un biopolímero, de modo que la matriz de sílice aportaba el carácter hidrofílico, el biopolímero mejoraba la inmovilización de la proteína y, con ello, el biosensor amperométrico mejoraba la transferencia iónica, proporcionando estabilidad mecánica y buena adhesión. Un ejemplo sobre la estrategia anterior corresponde al biosensor realizado por Zanini y col., quienes 10 emplearon un hidrogel de laponita en presencia de quitosano sobre un sustrato masivo de carbón vítreo para la medida de lactato en alimentos presentando una sensibilidad de 0.326 ± 0.003 A cm-2 M-1 y un límite de detección de (3.8 ± 0.2) x 10-3 M [V.P. Zanini, B. López De Mishima, V. Solís, Sensors and Actuators, B: Chemical 155 (2011) 75; X. Li, J. Zang, Y. Liu, Z. Lu, Q. Li, C.M. Li, Analytica Chimica Acta 771 (2013) 102]. Sin embargo el biosensor fue 15 probado únicamente para la determinación de lactato en bebidas alcohólicas y productos lácteos. No obstante,...

1. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato basado en la enzima lactato oxidasa (LOD) que comprende las siguientes etapas:

1. Dispersión del biopolímero en disolvente orgánico.

2. A la dispersión anterior se adicionan un mediador y nanotubos de carbono, para dar lugar a la disolución mediadora.

3. Preparación de la disolución enzimática disolviendo al menos la enzima LOD en una disolución tampón a pH neutro. 10

4. Adición de la disolución mediadora obtenida en la etapa 2 sobre una plataforma serigrafiada.

5. Adición de la disolución enzimática obtenida en la etapa 3 sobre la plataforma serigrafiada y la disolución mediadora.

6. Secado del biosensor para la eliminación del disolvente. 15

2. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato según la reivindicación 1, donde el biopolímero utilizado es quitosano.

3. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato según la 20 reivindicación 1, donde el biopolímero utilizado está basado en polisacáridos de glucosa o amilosa, funcionalizados con grupos hidroxilo, amino, acetilo o carboxílico, que contienen enlaces glucosídicos, como son el almidón, la quitina, el ácido hialurónico, el glucógeno y la celulosa.

4. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato según la reivindicación 1, donde el disolvente orgánico es dimetilformamida o una combinación de dimetilformamida y etanol.

5. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato según la 30 reivindicación 4, donde la combinación de dimetilformamida y etanol es en proporción 1:3 (v:v) .

6. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato según la 35 reivindicación 1, donde el mediador utilizado es el ferroceno metanol.

7. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato según la reivindicación 1, donde los nanotubos de carbono utilizados son de pared múltiple y están funcionalizados con grupos oxigenados. 40

8. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato según la reivindicación 1, donde la disolución enzimática se prepara con la enzima lactato oxidasa (LOD) , junto a la enzima peroxidasa de rábano silvestre (HRP) .

9. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato según la reivindicación 1, donde la plataforma serigrafiada es de grafito desechable, de tipo convencional, microelectrodo, array, microarray, microbanda o microbanda en serie, para conferir versatilidad y rapidez al sistema.

10. Procedimiento de preparación de un biosensor amperométrico de lactato según la reivindicación 1, donde el secado se realiza a 2-5 ºC o a 25 ºC bajo condiciones de alto vacío durante 1 hora y después se almacena a 2-5 ºC al aire.

11. Biosensor amperométrico de lactato basado en la enzima lactato oxidasa (LOD) obtenido por el procedimiento descrito en la reivindicación 1, formado por un sustrato de grafito serigrafiado soportado sobre un polímero aislante flexible, una matriz carbonosa conductora formada por la combinación de un sistema enzimático que 5 contiene al menos la enzima LOD, nanotubos de carbono funcionalizados y el biopolímero para la inmovilización de la enzima.

12. Uso del biosensor amperométrico de lactato basado en la enzima lactato oxidasa (LOD) descrito en la reivindicación 11 en medios complejos, incluidos los medios de 10 cultivo embrionario utilizados en técnicas de reproducción asistida humana y otros medios utilizados en el desarrollo celular.

13. Uso del biosensor amperométrico de lactato basado en la enzima lactato oxidasa (LOD) descrito en la reivindicación 11 en muestras alimentarias provenientes del 15 sector vinícola y cervecero.

14. Uso del biosensor amperométrico de lactato basado en la enzima lactato oxidasa (LOD) descrito en la reivindicación 11 en la determinación de los niveles de lactato en sangre. 20