Plataforma de alto rendimiento para cribados subcelulares in vivo en larvas de vertebrados.

Sistema de alto rendimiento para cribados in vivo, que comprende:

una fuente de un organismo de muestra en un medio líquido;

una bomba de jeringa para cargar automáticamente el organismo de muestra en el medio líquido de la fuente en un tubo capilar de vidrio;

una etapa de posición en 3 ejes para colocar automáticamente el organismo de muestra en el tubo capilar de vidrio dentro del campo de visión de un aparato de formación de imágenes; y

un conjunto de motor y capilar operable para girar el tubo capilar de vidrio, de modo que se rota el organismo de muestra dentro del campo de visión-del aparato de formación de imágenes, de modo que se proporciona un cribado de resolución subcelular de alto contenido.

Plataforma de alto rendimiento para cribados subcelulares in vivo en larvas de vertebrados Antecedentes de la invención Esta invención se refiere a una plataforma de cribado de alto rendimiento y más particularmente a una plataforma de alto rendimiento capaz de realizar cribados genéticos y químicos in vivo en los organismos de muestras tales como larvas de pez cebra y otros teleósteos.

Los modelos de animales pequeños, como el pez cebra (Danio rerio) facilitan el estudio de procesos complejos a gran escala que no pueden replicarse in vitro, tales como: el desarrollo de órganos; la degeneración y regeneración neural; la proliferación y la migración de células madre; las funciones de los sistemas cardiovascular, inmunológico, endocrino y nervioso; la progresión de enfermedades infecciosas; la patogenia; la progresión del cáncer y la especificidad tisular y la toxicidad de los fármacos. Varias características deseables del pez cebra han alimentado su popularidad, incluyendo el pequeño tamaño del animal, la transparencia óptica, el hábitat acuático y la simplicidad del cultivo. Se han desarrollado modelos en pez cebra de varias enfermedades humanas1-11. Los superíndices se refieren a las referencias incluidas en el presente documento. Los contenidos de todas estas referencias se incorporan en el presente documento por referencia. Los compuestos principales descubiertos mediante el cribado de bibliotecas de compuestos químicos para la eficacia en modelos de enfermedad en pez cebra han sido útiles para el desarrollo farmacéutico debido al alto nivel de conservación de la actividad del fármaco entre los mamíferos y el pez cebra12, 13. La disponibilidad de un gran número de cepas mutantes y manipulaciones genéticas tales como la sobreexpresión, la inactivación y la silenciación de genes convierten al pez cebra en un potente modelo para estudios genéticos y para la identificación de las dianas celulares de nuevos compuestos1, 14, 15. Las ventajas significativas del pez cebra han impulsado el crecimiento exponencial de su uso en investigaciones experimentales en las últimas dos décadas1.

Varias compañías y laboratorios académicos están llevando a cabo cribados genéticos y de compuestos con larvas de pez cebra incubados en placas de 96 pocillos1, 2, 4, 12. Debido a que la manipulación del pez cebra ha sido en gran parte manual, los cribados típicos de alto contenido de pez cebra se limitan a unos pocos miles de compuestos a la semana. Los ensayos de resolución subcelular requieren acceso óptico a una región específica de la muestra para la formación de imágenes o la manipulación. El acceso claro a menudo se e obstaculizado por órganos intermedios tales como los ojos y el corazón. La yema de huevo y algunos órganos presentan una autofluorescencia significativa. Además, las pigmentaciones de la piel pueden bloquear la región de interés. La visualización de la mayoría de las regiones requiere orientar al pez cebra apropiadamente. Sin embargo, los métodos de orientación de la muestra actuales requieren la introducción de la muestra en medios viscosos tales como agar y / o girar manualmente el pez con pinzas. Estos procesos son demasiado lentos y poco fiables para cribados de alto rendimiento. Además, las muestras no pueden reorientarse rápidamente una vez que se han fijado, de modo que se impide la visualización de los órganos desde múltiples ángulos. Ejemplos de ensayos que requieren orientación de la muestra y formación de imágenes de resolución subcelular incluyen la vigilancia in vivo del crecimiento tumoral temprano, la degeneración neuronal, la regeneración de neuritas y la proliferación y la migración de células madre en los tejidos que comprenden el cerebro, los ojos, el corazón, el páncreas, los riñones y el hígado.

El documento WO 2009/049740 se refiere a un método para colocar al menos una muestra biológica, preferiblemente, en el espacio de muestra de una disposición microscópica y dispositivos para realizar dicho método. En los métodos y dispositivos propuestos, la orientación de la muestra se puede variar varias veces en relación con el eje óptico de un objetivo de detección y la muestra se sujeta a fin de garantizar la vista más posible sin las mayores restricciones posibles de la muestra desde cada dirección de detección, donde, en diferentes formas de realización, la muestra se sujeta en un dispositivo de soporte mediante fuerzas de adhesión, la muestra se sujeta en un dispositivo de soporte mediante un medio de flujo, la muestra se sujeta por efecto capilar en una abertura capilar, o, al menos una muestra se embebe en una cuerpo hecho de una arena de gel transparente, el cuerpo de gel se fija por medio de un dispositivo de sujeción rotatorio en el espacio de muestra, donde la dirección de detección se altera mediante un ángulo de giro predeterminado después de la rotación del dispositivo de sujeción.

El artículo de Funfak et al. titulado "Micro fluid segment technique for screening and development on Danio rerio embr y os" Lab on a Chip 2007, 7:1132 -1138 describe la aplicabilidad de segmentos de microfluidos para el estudio del comportamiento de los sistemas multicelulares. Se determinó que era posible introducir los huevos de vertebrados dentro de los segmentos de microfluido sin producir un daño significativo o la inhibición de su desarrollo y que las concentraciones enormes de dodecilsulfato sódico limitan el desarrollo del embrión, dependiendo tanto de tiempo de incubación como de la concentración de cloruro de cobre (II) añadido.

El artículo titulado "Automated Image-base Phenotypic Analysis in Zebrafish Embr y os", Developmental Dynamics, vol. 238 1 Januar y 2009, pp 656 -663, describe un sistema automatizado para la formación de imágenes y el análisis de embriones de pez cebra en placas de múltiples pocillos independientemente de la orientación del embrión y sin intervención del usuario. El método de análisis de imagen empleado de la tecnología de red de cognición hizo factible medir fenotipos de organismos enteros complejos.

El documento WO 2010/014244 se refiere a un método y dispositivo para la microscopia de iluminación de plano selectivo multidireccional. Un plano focal detector es iluminado de forma alterna con al menos dos láminas de luz coplanar de contrapropagación y se detecta una imagen, de una sección transversal de la muestra colocada en el plano focal, mientras que solo una lámina de luz ilumina la muestra. El frente de onda de los haces de iluminación se puede deformar con óptica adaptativa usando retroalimentación de la luz transmitida a través de la muestra. Se pueden detectar varias imagines de la sección transversal de la muestra a diferentes tiempos y posiciones y orientaciones de la muestra para producir pilas de imágenes de múltiples vistas que se pueden procesar usando fusión de imágenes para producir una representación de imagen reconstruida de la muestra. Adicionalmente, la dirección de la propagación de las láminas de luz alternas se puede pivotar en el plano focal al tiempo que se detecta la imagen.

Sumario de la invención En un aspecto, el sistema de alto rendimiento de la invención para cribados in vivo incluye una de las características mencionadas en la reivindicación 1. La invención también se refiere a un método para cribados de alto rendimiento in vivo, que comprende las etapas citadas en la reivindicación 18 y un sistema automatizado para cribados in vivo con vertebrados, larvas que comprenden las etapas citadas en la reivindicación 43. Los organismos de muestra adecuados incluyen teleósteos u otros animales acuáticos y embriones. Un teleósteo preferido es la larva de pez cebra.

En una realización preferida, las larvas son peces cebra. Se prefiere que la fuente de las larvas sea un depósito o una placa de múltiples pocillos. El depósito puede incluir un depósito de peces y un depósito de líquido. Se prefiere que la placa de múltiples pocillos sea una placa de 96 pocillos y que se asiente en una etapa en posición x-y. En aún otra realización preferida, el conjunto detector incluye dos diodos emisores de luz y un fotodiodo de alta velocidad dispuestos en configuraciones de transmisión y reflexión. En una realización, los medios de formación de imágenes incluyen un par de motores de paso para la rotación de un tubo capilar para reorientar una larva. El tubo capilar puede ser, preferentemente, de vidrio o teflón.

En aún otra realización, los medios de formación de imágenes incluyen una lente objetivo de inmersión en agua de potencia 20 para la formación de imágenes confocales. Los medios de formación de imágenes también incluyen una lente objetivo invertida de potencia 10 para la formación de imágenes de campo claro.... [Seguir leyendo]

1. Sistema de alto rendimiento para cribados in vivo, que comprende:

una fuente de un organismo de muestra en un medio líquido; una bomba de jeringa para cargar automáticamente el organismo de muestra en el medio líquido de la fuente en un tubo capilar de vidrio; una etapa de posición en 3 ejes para colocar automáticamente el organismo de muestra en el tubo capilar de vidrio dentro del campo de visión de un aparato de formación de imágenes; y un conjunto de motor y capilar operable para girar el tubo capilar de vidrio, de modo que se rota el organismo de muestra dentro del campo de visión-del aparato de formación de imágenes, de modo que se proporciona un cribado de resolución subcelular de alto contenido.

2. El sistema de la reivindicación 1, donde el organismo de muestra es un teleósteo.

3. El sistema de la reivindicación 1, donde la fuente es un depósito que contiene una pluralidad de organismos de muestra.

4. El sistema de la reivindicación 1, donde la fuente es una placa de múltiples pocillos que contiene una pluralidad de organismos de muestra.

5. El sistema de la reivindicación 3, donde la fuente se puede cambiar entre los organismos de muestra y un suministro de líquido.

6. El sistema de la reivindicación 4, donde un conjunto de tubo se coloca sobre la placa de múltiples pocillos de una etapa de posición.

7. El sistema de la reivindicación 6, donde el conjunto de tubo incluye un tubo de inyección para inyectar fluido y un tubo de aspiración para aspirar un organismo de muestra desde la placa de múltiples pocillos.

8. El sistema de la reivindicación 6, donde el conjunto de tubo y placa de múltiples pocillos se puede sellar.

9. El sistema de la reivindicación 1, donde el sistema incluye un detector automático que tiene una o más fuentes de luz y uno o más detectores de luz dispuestos en las configuraciones de transmisión y/o reflexión.

10. El sistema de la reivindicación 9, donde el detector automático diferencia burbujas de aire y / o desechos de los organismos de muestra.

11. El sistema de la reivindicación 1, donde el tubo incluye una porción que es un vidrio o cuarzo o capilar de polímero transparente dentro del campo de visión del aparato de formación de imágenes.

12. El sistema de la reivindicación 1. donde el aparato de formación de imágenes incluye al menos un motor para hacer girar el tubo dentro del campo de visión del aparato de formación de imágenes.

13. El sistema de la reivindicación 1, donde el aparato de formación de imágenes las obtiene simultáneamente a través de dos lentes de objetivo.

14. El sistema de la reivindicación 1, donde el aparato de formación de imágenes tiene capacidad de formación de imágenes confocales y / o de dos fotones y / o de campo amplio.

15. El sistema de la reivindicación 1, donde el aparato de formación de imágenes incluye un láser que genera un haz adecuado para la ablación y / o la fotoactivación y / o la fotoestimulación.

16. El sistema de la reivindicación 1, donde el sistema se utiliza para realizar cribados genéticos.

17. El sistema de la reivindicación 1, donde el sistema se utiliza para realizar cribados químicos.

18. Método para el cribado de alto rendimiento in vivo, que comprende:

proporcionar una fuente de un organismo de muestra en un medio líquido; cargar automáticamente mediante una bomba de jeringa el organismo de muestra en el medio líquido en un tubo capilar de vidrio desde la fuente; colocar automáticamente mediante una etapa de posición en 3 ejes el organismo de muestra en el tubo capilar de vidrio dentro del campo de visión de un aparato de formación de imágenes; y rotar el organismo de muestra en el medio líquido en el tubo capilar de vidrio dentro del campo de visión, proporcionando de ese modo un cribado de resolución subcelular de alto contenido.

19. El método de la reivindicación 18 que incluye además la clasificación de los organismos de muestra en múltiples recipientes.

20. El método de la reivindicación 18, que incluye pasar los organismos de muestra a través del sistema múltiples veces.

21. El método de la reivindicación 18 que incluye además la exposición del organismo de muestra a un compuesto para visualizar los efectos agudos.

22. El método de la reivindicación 18 para recuento in vivo de alto rendimiento.

23. El método de la reivindicación 18 para la medición de cambios morfológicos en vivo.

24. El método de la reivindicación 18 para la medición de la morfología celular.

25. El método de la reivindicación 18 para la medición de la migración celular.

26. El método de la reivindicación 18 para la medición de las señales de Ca2+.

27. El método de la reivindicación 18 utilizado para la manipulación óptica a resolución celular usando microablación láser.

28. El método de la reivindicación 18 utilizado para la fotoestimulación de canales iónicos.

29. El método de la reivindicación 18 utilizado para la fotoactivación o fotoinactivación de productos químicos y proteínas.

30. El método de la reivindicación 18 utilizado para cribados de regeneración de productos químicos que potencian la proliferación de células progenitoras.

31. El método de la reivindicación 18 utilizado para cribados tumorales para productos químicos inhibitorios dirigidos a la proliferación de células tumorigénicas in vivo.

32. El método de la reivindicación 18 utilizado para cribados de productos químicos protectores que reducen o detienen la muerte celular en los modelos de enfermedades degenerativas.

33. El método de la reivindicación 18 usado para los cribados de toxicidad.

34. El método de la reivindicación 18 usado para cribados genéticos y químicos sobre el desarrollo y la organogénesis.

35. El método de la reivindicación 18 de cribados sobre la morfología neuronal, tales como ramificación de las neuritas, el crecimiento, la conectividad, y la densidad de la columna vertebral.

36. El método de la reivindicación 18 usado para cribados sobre la migración de células madre.

37. El método de la reivindicación 18 usado para cribados sobre la función cardiovascular y la salud.

38. El método de la reivindicación 27 utilizado para cribados que potencian la regeneración de tejidos específicos después de la lesión precisa.

39. El método de la reivindicación 27 usado para cribados que compensan la función después de la ablación de células específicas.

40. El método de la reivindicación 18 usado para cribados sobre los linajes y diferenciación celular.

41. El sistema de acuerdo con la reivindicación 2, donde el teleósteo es pez cebra.

42. El sistema de la reivindicación 1, donde el organismo de muestra es transgénico.

43. Un sistema automático para cribados en vivo con larvas de vertebrados, que comprende:

una fuente de larvas de vertebrados en un medio líquido; una bomba de jeringa automática para aspirar una larva en el medio líquido al interior de un tubo capilar de vidrio; una sección de detección automático del sistema posicionado alrededor del tubo capilar de vidrio para diferenciar 9

el paso de una larva de las burbujas y / o los desechos n el tubo capilar de vidrio; un aparato de formación de imágenes configurado para obtener la imagen de la larva en el tubo capilar de la clase; y un conjunto de motor de 3 ejes y capilar operable para girar el tubo capilar de vidrio, de modo que se gira la larva dentro del campo de visión del aparato de formación de imágenes.