Placenta post-parto de mamíferos, su uso y células madre placentarias de la misma.

Una población homogénea aislada de células madre placentarias humanas,

en donde dichas células madre placentarias son fibroblastos y se pueden obtener mediante un método que comprede:

recoger células placentarias de una placenta humana, en donde dicha placenta ha sido drenada de la sangre del cordón y enjuagada para eliminar la sangre residual;

cultivar dichas células placentarias; y

aislar dichas células madre placentarias de dichas células placentaria mediante tripsinización diferencial, en donde dicha célula madre placentaria no es obtenida a partir de la sangre del cordón; y

en donde las células madre placentarias son OCT-4+ y ABC-p+; o SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+; o CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT- 4+, y ABC-p+.

Placenta post-parto de mamíferos, su uso y células madre placentarias de la misma

1. INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere a métodos de exsanguinación y perfusión de la placenta después de la expulsión desde el útero, p. ej., después del nacimiento. La presente invención se refiere a métodos de tratamiento y cultivo de una placenta aislada para la propagación de células madre de tipo embrionario que se originan a partir de la placenta y de fuentes exógenas. Se describe en la presente invención el uso de una placenta cultivada como un biorreactor para producir materiales biológicos o células de cultivo, tejidos y organoides. La presente invención también se refiere a la recogida y propagación de células madre, y en particular, a la recogida de células madre de tipo embrionario y otras células madre multipotentes a partir de placentas. La presente invención se refiere a células madre de tipo embrionario que se originan a partir de una placenta post-parto.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe un interés considerable en la identificación, aislamiento y generación de células madre humanas. Las células madre humanas son células precursoras totipotentes o pluripotentes capaces de generar una variedad de linajes de células humanas maduras. Esta capacidad sirve como base para la diferenciación y especialización celulares necesarias para el desarrollo de órganos y tejidos.

El reciente éxito en el transplante de tales células madre ha proporcionado nuevas herramientas clínicas para reconstituir y/o complementar la médula ósea después de la mieloablación debida a enfermedad, exposición a agentes químicos tóxicos y/o radiación. Existe una evidencia adicional que demuestra que las células madre pueden ser empleadas para repoblar muchos, sino todos, los tejidos y restaurar la funcionalidad fisiológica y anatómica. La aplicación de células madre en la manipulación genética de tejidos, la liberación de terapia génica y la terapéutica celular también está avanzando rápidamente.

Se han caracterizado muchos tipos diferentes de células madre de mamífero. Por ejemplo, se conocen células madre embrionarias, células germinales embrionarias, células madre adultas u otras células madre comprometidas o células madre progenitoras. Ciertas células madre no solo han sido aisladas y caracterizadas sino que también han sido cultivadas en condiciones que permiten la diferenciación en un grado limitado. No obstante, sigue habiendo un problema básico, ya que obtener cantidades suficientes y poblaciones de células madre humanas que sean capaces de diferenciarse en todos los tipos de células es casi imposible. La producción de células madre es críticamente escasa. Éstas son importantes para el tratamiento de una amplia gama de trastornos, incluyendo tumores malignos, errores innatos del metabolismo, hemoglobinopatías, e inmunodeficiencias. Resultaría muy ventajoso tener una fuente de más células madre embrionarias.

La obtención de un número suficiente de células madre humanas ha sido problemática por varias razones. En primer lugar, el aislamiento de poblaciones normales de células madre en tejidos adultos ha sido técnicamente difícil y costosa debido, en parte, a la cantidad muy limitada encontrada en la sangre o los tejidos. En segundo lugar, la obtención de estas células a partir de embriones o de tejido fetal, incluyendo abortos, ha planteado problemas religiosos y éticos. La creencia ampliamente sostenida de que el embrión humano y el feto constituyen vida independiente ha dado lugar a restricciones gubernamentales en el uso de tales fuentes para todos los fines, incluyendo la investigación médica. Por lo tanto las fuentes alternativas que no requieren el uso de células obtenidas de tejido embrionario o fetal son esenciales para un progreso adicional en la utilización de células madre clínicamente. Existen, por consiguiente, pocas fuentes alternativas viables de células madre, concretamente células madre humanas, y por lo tanto el suministro es limitado. Además, la recogida de las células madre a partir de fuentes alternativas en cantidades adecuadas para fines terapéuticos y de investigación es generalmente laboriosa, implicando, p. ej., la recogida de células o tejidos de un sujeto donante o un paciente, el cultivo y/o la propagación de las células in vitro, la disección, etc.

Por ejemplo, Caplan et al. (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.486.359 titulada "Human mesenchymal stem cells, " presentada el 23 de Enero, 1996) , describe composiciones de células madre mesenquimales humanas (hMSC) derivadas de médula ósea que sirven como progenitoras de linajes de células mesenquimales. Caplan et al, describen que las hMSC se identifican por medio de marcadores específicos de la superficie celular que se identifican con anticuerpos monoclonales. Las composiciones de hMSC homogéneas se obtienen mediante selección positiva de células de médula o periosteales adherentes que están libres de marcadores asociados con células hematopoyéticas o células mesenquimales diferenciadas. Estas poblaciones de células mesenquimales aisladas presentan características epitópicas asociadas con las células madre mesenquimales, tienen la capacidad de regenerarse en cultivo sin diferenciarse, y tienen la capacidad de diferenciarse en linajes mesenquimales específicos cuando son inducidas in vitro o colocadas in vivo en el sitio de un tejido dañado. La desventaja de tales métodos, no obstante, es que requieren la recogida de células de médula o periosteales de un donante, a partir de las cuales se pueden aislar con posterioridad las MSC.

Hu et al. (documento WO 00/73421 titulado "Methods of isolation, cr y opreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells", publicado el 7 de Diciembre, 2000) describen células epiteliales amnióticas humanas

derivadas de placenta en el parto, que se aíslan, se cultivan, se crioconservan para su futuro uso, o se induce su diferenciación. De acuerdo con Hu et al., se recoge una placenta inmediatamente después del parto y se separa la membrana amniótica del corion, p. ej., mediante disección. Las células epiteliales amnióticas se aíslan de la membrana amniótica de acuerdo con las técnicas de aislamiento de células convencionales. Las células descritas se pueden cultivar en diferentes medios, expandir en cultivo, crioconservar, o inducir su diferenciación. Hu et al. describen que las células epiteliales amnióticas son multipotenciales (y posiblemente pluripotenciales) , y se pueden diferenciar en tejidos epiteliales tales como epitelio de la superficie de la córnea o epitelio vaginal. La desventaja de tales métodos, sin embargo, es que son trabajosos y el rendimiento de células madre es muy bajo. Por ejemplo, para obtener un número suficiente de células madre para fines terapéuticos o de investigación típicos, las células epiteliales amnióticas se deben aislar primero del amnion mediante técnicas de disección y separación de células, a continuación se deben cultivar y expandir in vitro.

La sangre de cordón umbilical (sangre de cordón) es una fuente alternativa conocida de células madre progenitoras hematopoyéticas. Las células madre de sangre de cordón se crioconservan de manera rutinaria para su uso en la reconstitución hematopoyética, un procedimiento terapéutico ampliamente utilizado en los transplantes de médula ósea y otros transplantes relacionados (véanse p. ej., Boyse et al., Documento U.S. 5.004.681, "Preservation of Fetal and Neonatal Hematopoietin Stem and Progenitor Cells of the Blood", Boyse et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.192.553, titulada "Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use", presentada el 9 de Marzo, 1993) . Las técnicas convencionales para la recogida de sangre del cordón se basan en el uso de una aguja o una cánula, que se utilizan con la ayuda de la gravedad para drenar la sangre del cordón (esto es, exsanguinación) desde la placenta (Boyse et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.192.553, presentada el 9 de Marzo, 1993; Boyse et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.004.681, presentada el 2 de Abril, 1991; Anderson, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.372.581, titulada Method and apparatus for placental blood collection, presentada el 13 de Diciembre, 1994; Hessel et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.415.665, titulada Umbilical cord clamping, cutting, and blood collecting device and method, presentada el 16 de Mayo, 1995) . La aguja o la cánula se colocan normalmente en la vena umbilical y la placenta se masajea suavemente para ayudar a drenar la sangre del cordón desde la placenta. Después de eso, sin embargo, se ha considerado... [Seguir leyendo]

1. Una población homogénea aislada de células madre placentarias humanas, en donde dichas células madre placentarias son fibroblastos y se pueden obtener mediante un método que comprede:

recoger células placentarias de una placenta humana, en donde dicha placenta ha sido drenada de la sangre del cordón y enjuagada para eliminar la sangre residual; cultivar dichas células placentarias; y aislar dichas células madre placentarias de dichas células placentaria mediante tripsinización diferencial, en donde dicha célula madre placentaria no es obtenida a partir de la sangre del cordón; y en donde las células madre placentarias son OCT-4+ y ABC-p+; o SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+; o CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT4+, y ABC-p+.

2. La población homogénea aislada de células madre placentarias de la reivindicación 1, en donde dichas células madre placentarias son OCT-4+ y ABC-p+.

3. La población homogénea aislada de células madre placentarias de la reivindicación 1, en donde dichas células madre placentarias son SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ y ABC-p+. 20

4. La población homogénea aislada de células madre placentarias de la reivindicación 1, en donde dichas células madre placentarias son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+.

5. La población homogénea aislada de células madre placentarias de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas células madre placentarias se adhieren al plástico del cultivo de tejidos.

6. La población homogénea aislada de células madre placentarias de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas células madre placentarias tienen el potencial para diferenciar entre células de un fenotipo neurgénico 30 u osteogénico o condrogénico.

7. Un cultivo que comprende la población homogénea aislada de células madre placentarias de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un método para aislar las células madre placentarias de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el método comprende:

perfusión de una placenta humana con una solución de perfusión, en donde la placenta ha sido exsanguinada y perfundida para eliminar la sangre residual; y 40 aislamiento de dichas células madre placentarias a partir de dicha solución de perfusión mediante tripsinización diferencial.

9. Una composición farmacéutica que comprende las células madre placentarias de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

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