Perfiles de anticuerpos específicos de un estado tuberculoso.

Un ensayo para los anticuerpos de la tuberculosis en una muestra de suero humano que es capaz de distinguir la tuberculosis activa de la tuberculosis inactiva,

que comprende:

(a) Exposición de los anticuerpos en la muestra a por lo menos tres diferentes antígenos de proteína de M. tuberculosis separadamente inmovilizados en diferentes lugares, en donde los tres diferentes antígenos M. tuberculosis incluyen:

(i) por lo menos un antígeno de un primer tipo cuyo reconocimiento serológico es consistente con la tuberculosis inactiva pero no la tuberculosis activa,

(ii) por lo menos un antígeno de un segundo tipo cuyo reconocimiento serológico es consistente con la tuberculosis activa pero no la tuberculosis inactiva y

(iii) por lo menos uno antígeno adicional seleccionado del grupo formado por el primero y el segundo tipo,

(b) Detección de la presencia o ausencia de anticuerpos séricos a dichos antígenos y (c) La determinación de una firma de antígenos bacterianos de la muestra como una combinación de la presencia y la ausencia de respuestas de anticuerpos ambiguas en donde la firma es una indicación de que la muestra es más que probable que contenga anticuerpos de la TB inactiva o la TB activa.

Perfiles de anticuerpos específicos de un estado tuberculoso.

ÁMBITO TECNICO

Esta invención se refiere a los ensayos para Mycobacteríum tuberculosis (M. tuberculosis).

ANTECEDENTES

El diagnóstico para la tuberculosis (TB) incluye tradicionalmente una combinación de la evidencia clínica, bacteriológica y radiográfica, típicamente las pruebas de cultivos y frotis, la prueba cutánea de la tuberculina (TST) y la radiografía de tórax.

Los anticuerpos específicos para un número de proteínas expresadas mediante la M. tuberculosis son detectables en el suero humano. Los ensayos de anticuerpos son rápidos y relativamente baratos y por lo tanto son un diagnóstico potencialmente valioso y una técnica de cribado. Existen varias categorías de diagnóstico de la tuberculosis (TB): enfermedad activa, TB inactiva (pasado) y dos categorías caracterizadas mediante la ausencia de anormalidad radiográfica en el tórax: la infección latente y la libre de infección. La detección de la TB activa es, por supuesto, clínicamente importante. La detección de la tuberculosis inactiva es clínicamente significativa, porque las personas con TB inactiva son de más de un orden de magnitud más propensas a desarrollar la TB activa que las personas que tienen la TB latente. La distinción entre TB activa de la tuberculosis inactiva es significativa desde el punto de vista de la salud pública, tal como permite la concentración de los recursos, que están a menudo muy limitados en los países más gravemente afectados por la tuberculosis, donde el peligro es mayor. La distinción de la TB inactiva de los estados caracterizados por radiografías de tórax normales es similarmente importante desde un punto de vista de la salud pública.

Los intentos de utilizar la detección de anticuerpos del suero para diagnosticar un estado de TB se han centrado en encontrar un antígeno o unos antígenos cuyo enlace se correlaciona positivamente con ese estado en particular, por ejemplo, los antígenos para quienes los resultados positivos de los ELISA (ensayo por inmuno absorción ligado a enzimas) señalan la TB activa. El diagnóstico de los estados de TB mediante pruebas de anticuerpos del suero ha sufrido de la falta de precisión.

Silva V M C et al., en el documento titulado "Factors associated with humoral response to ESAT-6, 38kDa and 14kDa in patients with a spectrum of tuberculosis" INTERNATIONAL JOURNAL OF TUBERCULOSIS AND LUNG DISEASE, 1UATLD, PARIS, FR, vol. 5, de 1 de mayo de 23, páginas 478-484, mide la respuesta humoral informe a los tres antígenos de M. tuberculosis 38kDa, 14kDa y ESAT-6 medidos con ELISA en pacientes con un espectro de condiciones relacionadas con la tuberculosis.

Un aspecto de esta invención son los ensayos para la detección de anticuerpos del suero humano con capacidad mejorada de predicción de los estados de TB de forma precisa, especialmente para discriminar entre la TB activa y la TB inactiva.

RESUMEN

Los estados de TB incluyen cinco clases reconocidas. Clase 1 (denominada a veces Clase -1) indica la ausencia de infección. En esta solicitud nos referimos a ese estado como "libre de infección". La Clase 2 es la infección latente. Las dos clases anteriores se caracterizan ambas por la ausencia de anormalidad radiográfica del tórax, a los cual algunas veces nos referimos como "tórax normal por rayos X' o, abreviadamente, "CXR normal". La Clase 3 es la tuberculosis activa. La Clase 4 es la tuberculosis inactiva. La Clase 5 es la tuberculosis sospechada, pendiente de diagnóstico. Este sistema de cinco clases fue adoptado por la Junta Directiva de la American Thoracic Society en Julio de 1999, en una declaración conjunta con los U.S. Centers for Disease Control (CDC) titulada "Targeted Tuberculin Testing and Treatment of Latent Tuberculosis Infection." La clasificación ha sido avalada por el Council of the Infectious Diseases Society of América. Véase Am. J. Respir. Crit. Care Med. (April 2) 164 (4 pt 2): S221-47. La Clase 4, la tuberculosis inactiva, tal y como está definida es "Tuberculosis; no clínicamente activa. Esta clasificación está definida por una historia de episodio(s) previos de la tuberculosis o de resultados radiográficos anormales estables en una persona con una reacción positiva a la prueba cutánea de la tuberculina, estudios bacteriológicos negativos (si se han realizado) y sin evidencia clínica y/o radiográfica de enfermedad actual. Las personas en la Clase 4 pueden no haber recibido quimioterapia, pueden estar recibiendo tratamiento para la infección latente o pueden haber completado un tratamiento previamente prescrito de quimioterapia."

Esta invención es un ensayo de anticuerpo del suero humano para la TB que es capaz de distinguir la TB inactiva de la TB activa tal como se define en la reivindicación 1. Los ensayos de acuerdo con esta invención se basan y utilizan la bien conocida reacción antígeno-anticuerpo. El tipo de protocolo, es decir, el análisis sándwich (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmuno complejos) o el análisis competitivo, no es crítico. Utilizo un ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) que es un formato sándwich que incluye como un primer antígeno inmovilizado reactivo y como un segundo reactivo un anti-anticuerpo etiquetado que se une a anticuerpos

inmovilizados por el primer reactivo. Sin embargo, pueden ser utilizados otros formatos para la detección de anticuerpos de suero. Véase, por ejemplo, Estados Unidos Números Re 3.654.9, 3.791.932, 3.85.752, 3.839.153 y 3.879.262.

Los ensayos de esta invención utilizan proteínas de M. tuberculosis como reactivos, tanto como el primer reactivo antígeno con el fin de inmovilizar los anticuerpos del suero o como los reactivos antígenos etiquetados o ambos. Los ensayos de esta invención están caracterizados por el uso de por lo menos 3 antígenos y por la inclusión de los antígenos de por lo menos dos tipos: en primer lugar, por lo menos un antígeno que es específico para un anticuerpo cuya presencia es un Indicador de la tuberculosis Inactiva en relación con la TB activa y, segundo, por lo menos un antígeno que es especifico para un anticuerpo cuya ausencia es un indicador de la tuberculosis Inactiva en relación con la TB activa. Cuando son utilizados en mi ensayo preferente de sándwich, una respuesta positiva desde un antígeno o antígenos del primer tipo acoplada con una respuesta negativa (es decir, la ausencia de una respuesta positiva) desde un antígeno o antígenos del segundo tipo es indicativa de tuberculosis inactiva como distinción de la TB activa. Los ensayos incluyen uno o más antígenos terceros seleccionados del grupo formado por el primer tipo y el segundo tipo.

Los ensayos de acuerdo con esta invención pueden ser realizados usando reacciones separadas en diferentes ubicaciones o recipientes, por ejemplo, puntos separados en una superficie de una tarjeta o palillo o pocilios separados de placas de mlcrotltulaclón. En tal formato, es posible la utilización de una etiqueta de formación de color tal como la peroxidasa de rábano ya que puede decir que antígeno o antígenos lideran una respuesta positiva, es decir en color. Los ensayos de acuerdo con esta Invención también pueden ser realizados utilizando reacciones separadas comúnmente en distintos lugares de una sola matriz, tal como ocurre cuando los primeros reactivos antígenos están inmovilizados en posiciones identificabas, separadas en la superficie de una matriz y la matriz completa está expuesta al suero, lavado, expuesto al segundo reactivo común, lavado de nuevo y leído. En este enfoque el segundo reactivo se etiqueta con una etiqueta de señalización, por ejemplo, una molécula fluorescente o un isótopo radiactivo, de tal manera que pueden ser detectados resultados positivos en las localizaciones individuales de vahos primeros reactivos antígenos.

Los ensayos preferentes de acuerdo con esta Invención están construidos de tal manera con el fin de tener dos resultados, el resultado positivo o el resultado negativo, para cada antígeno. Para el tipo de sándwich de ELISA que he utilizado y que se describe en esta solicitud, se establece el punto de división (punto de corte) entre positivo y negativo y se ajusta la concentración del antígeno u otras condiciones en el ensayo para que solamente resultados por encima del corte proporcionen un resultado positivo. Esto puede ser ilustrado mediante la referencia a la Tabla 3. En la Tabla 3, cuatro antígenos AlaDH, los resultados promedio fueron: para los casos de TB activa, ,199; para los casos de TB inactiva, ,14; y para los casos que fueron CXR normales, ,16. En el diseño de un ensayo la concentración del antígeno puede ser ajustada con el fin de proporcionar el corte deseado, es decir,... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo para los anticuerpos de la tuberculosis en una muestra de suero humano que es capaz de distinguir la tuberculosis activa de la tuberculosis inactiva, que comprende:

(a) Exposición de los anticuerpos en la muestra a por lo menos tres diferentes antígenos de proteína de M. tuberculosis separadamente inmovilizados en diferentes lugares, en donde los tres diferentes antígenos M. tuberculosis incluyen:

(i) por lo menos un antígeno de un primer tipo cuyo reconocimiento serológico es consistente con la tuberculosis inactiva pero no la tuberculosis activa,

(¡i) por lo menos un antígeno de un segundo tipo cuyo reconocimiento serológico es consistente con la tuberculosis activa pero no la tuberculosis inactiva y

(i¡¡) por lo menos uno antígeno adicional seleccionado del grupo formado por el primero y el segundo tipo,

(b) Detección de la presencia o ausencia de anticuerpos séricos a dichos antígenos y (c) La determinación de una firma de antígenos bacterianos de la muestra como una combinación de la presencia y la ausencia de respuestas de anticuerpos ambiguas en donde la firma es una indicación de que la muestra es más que probable que contenga anticuerpos de la TB inactiva o la TB activa.

2. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 que incluye al menos un antígeno del primer tipo seleccionado del grupo consistente del antígeno 16kDa (producto del gen rv231 c) y el antígeno ESAT-6 (producto del gen rv 3875).

3. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que incluye por lo menos un antígeno del segundo tipo seleccionado en el grupo formado por el antígeno Rv2626c, el antígeno AlaDH (producto del gen rv 278) y el antígeno 38kDa (producto de gen rv 934).

4. El ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 que incluye por lo menos dos antígenos del primer tipo y por lo menos dos antígenos del segundo tipo.

5. El ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 que incluye por lo menos tres antígenos de un tercer tipo cuyo reconocimiento serológico es compatible con la tuberculosis inactiva y la TB activa pero no con las muestras de la tuberculosis latente o libre de infección, en donde las señales fuertes con los dichos por lo menos tres antígenos del tercer tipo es una indicación de que la muestra contiene con toda seguridad anticuerpos para la tuberculosis activa o la tuberculosis inactiva que la tuberculosis latente o que es una muestra libre de infección.

6. El ensayo de la reivindicación 5 en donde por lo menos un antígeno del tercer tipo también es un antígeno del primer tipo.

7. El ensayo de la reivindicación 5 ó 6 en donde los antígenos del tercer tipo incluyen por lo menos un antígeno seleccionado desde el grupo formado por el antígeno 16kDa, el antígeno ESAT-6 y el antígeno FdxA (producto del gen rv 27c).