Parvovirus de roedor modificado capaz de propagarse y extenderse en los gliomas humanos.

Una variante H-1 de parvovirus de rata capaz de propagarse y extenderse en las células tumorales humanas,

caracterizada por que los polipéptidos virales comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Figura 8B y que tienen una deleción desde la posición 587 a la 629 en el término C de NS1 y las sustituciones P124Q y E180K en NS1, una deleción desde la posición 95 a 136 en el exón medio de NS2 y la sustitución de aminoácido H374Y en VP1/VP2.

Parvovirus de roedor modificado capaz de propagarse y extenderse en los gliomas humanos La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Así, la misma se refiere a una variante de parvovirus de rata H-1 capaz de propagarse y extenderse en los las células de tumores humanos, caracterizada porque los péptidos virales comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Figura 8B y que tienen una deleción desde la posición 587 a 629 en el término C de NS1 y las sustituciones P124Q y E280K en NS1, una deleción desde la posición 95 a la 136 en el exón medio de NS2 y la sustitución de aminoácidos H374Y en VP1/VP2.

Los virus oncolíticos tales como parvovirus de roedor representan nuevas herramientas para el tratamiento del cáncer. Además de destruir específicamente las células del cáncer (oncólisis) , estos agentes proporcionan también señales de peligro que incitan al sistema inmune a eliminar los tumores infectados con el virus. Como consecuencias de eventos oncolíticos, los sistemas inmunes innato y adaptativo logran Acceso a los antígenos tumorales, lo que da como resultado efectos de cebado cruzado y vacunación. Los parvovirus de roedor son virus de DNA monocatenario que poseen actividad oncolítica intrínseca, es decir los mismos se replican preferiblemente en las células de cáncer de origen tanto murino como humano y las destruyen.

El glioblastoma es una enfermedad devastadora con sólo posibilidades de tratamiento limitadas. Evidentemente, la prognosis para los pacientes requiere nuevas terapias. Los virus oncolíticos competentes en replicación arriba expuestos se consideran prometedores dado que son capaces de extenderse en los tejidos malignos e inducir respuestas inmunes antitumorales. Entre ellos, los parvovirus de roedor parecen ser candidatos excelentes debido a 20 su oncotropismo natural, su capacidad para infectar células humanas, la toxicidad específica para las células neoplásticas, y la baja patogenicidad para los humanos. En un modelo de rata, H1-PV era capaz de causar una regresión completa de gliomas establecidos sin relapso alguno, y demostró ser capaz de direccionarse a diversos gliomas humanos, destruyendo por ello eficientemente estas células con indiferencia de su resistencia adquirida hacia inductores de muerte conocidos. Aunque H1-PV resultó capaz de infectar y destruir eficientemente la mayoría 25 de los linajes de células de glioblastoma humano ensayadas hasta ahora, la mayoría de estas células resistían la replicación eficiente del virus, la producción de partículas de progenie y la propagación. Este fallo en propagarse y extenderse en los tejidos de tumor humanos podría tener un impacto importante para la eficacia del tratamiento de los gliomas humanos in vivo, no sólo debido a que la destrucción de las células se limita a un solo evento exitoso que alcanzaba únicamente una proporción limitada de las células tumorales, sino también debido a la falta de un trasporte intracelular activo de viriones de la progenie a la superficie celular.

Por tanto, es un objeto de la presente invención resolver este inconveniente de las cepas de la técnica anterior, es decir, proporcionar parvovirus que sean capaces de propagarse y extenderse en un tejido tumoral humano.

Conforme a la invención, esto se consigue por las materias objeto definidas en las reivindicaciones. Experimentos iniciales de los inventores han demostrado que los viriones de PV de la progenie se desplazan desde el núcleo a la 35 periferia de la célula por vesículas antes de la lisis celular en la que los mismos se liberan al medio sobrenadante. Además, este escape vesicular está asociado con proteínas intracelulares múltiples (que incluyen antígenos tumorales potenciales) que son transportados como "co-carga" a la superficie celular y podrían contribuir a la estimulación inmune antitumoral del hospedador. Para corregir los efectos del aislado de H1-PV original (pSR19) en la propagación y extensión del virus en el glioblastoma humano, los inventores intentaron obtener variantes de H140 PV competentes en propagación por pasadas en serie en linajes de células de glioblastoma humano procedentes de pacientes semi-permisivos, es decir, soslayar los potenciales cuellos de botella durante el proceso de infección (eliminación de la cápsida, suministro del genoma viral al núcleo, conversión en doble cadena) se transfectó DNA de clon infeccioso de H1-PV (pSR-19) a linajes de células de glioblastoma humano diferentes (v.g. NCH149, NCH82, NCH89) y este DNA competente en replicación se sometió a pases hasta que se hicieron visibles los efectos 45 citopáticos. Se realizaron pases virales adicionales (> 15) combinando los viriones de la progenie asociados a las células obtenidos por congelación y descongelación repetidas en vTE de pH 8.7 con virus liberados del medio por infección. Un conjunto de virus competentes en propagación se analizó luego después de 25 pases en células NCH149 que presentaban amplificación eficiente del DNA viral, generación de viriones de la progenie y propagación en una diversidad de cultivos de glioblastoma humano. A partir de este conjunto original, se aislaron clones de virus 50 individuales por purificación de calvas en células NB324K, se amplificaron una vez más en células NCH149, se clonaron y se secuenciaron.

El análisis genético de todas las variantes de H1-PV ha revelado una deleción de 84 nucleótidos que afecta a 28 aminoácidos de la región codificante de NS1 (término C) y NS2 y una sola transición de citosina a timidina en la posición 3913 que cambia His374 a Tyr en VP2. Dos sustituciones adicionales de guanidina a adenosina en la 55 región VP2 (3964 y 4108) conducentes a un cambio de Asp391 a Asn y Asp439 a Ser han sido asignadas únicamente a dos aislados. Quedaban un pequeño número de cambios en las regiones 3' no codificantes, con prevalencia diversa. Aparentemente, la región situada aproximadamente entre los nucleótidos 2000 y 2200 comprende un punto caliente de variabilidad que permite que H1-PV, por modulación de la función NS1/NS2 se adapte al ambiente hospedador. Por tanto, es posible modificar activamente el intervalo de hospedadores de H1-PV,

pero también de las otras cepas de PV de rata estrechamente relacionadas, H3 y TVX por inserción/deleciones dentro de esta región.

Las variantes de H1-PV de nueva generación son capaces de propagarse y extenderse en los linajes de células de glioblastoma humano. Esto permite una infección/destrucción incrementada de tumores humanos ya establecidos y, en consecuencia, se espera que dé lugar una mejor estimulación inmune anti-tumoral. De acuerdo con los descubrimientos previos de los inventores del escape de vesículas de parvovirus, es razonable suponer que el cotransporte de proteínas intracelulares a la superficie podría servir para desenmascarar células tumorales para una respuesta inmune del hospedador. Este efecto de co-carga no está presente en ausencia de formación de viriones de la progenie utilizando el aislado de H1-PV original (pSR-19) .

Sumario de la presente Invención Con el proceso de adaptación (sometimiento a pases) en células semi-permisivas como se reseña en los ejemplos, pudo generarse una variante H1-PV muy eficiente para propagación en muchos otros linajes de células de glioblastoma humano. El procedimiento reseñado puede extenderse a otros linajes de células de tumores humanos, con inclusión de células madre tumorales.

La adaptación del H1-PV de rata en las células del glioblastoma humano condujo a una deleción en el término C de H1 NS1/exón medio de NS2. Esta región representa un área de punto caliente para variación que determina el intervalo de hospedadores de H1-PV y con adaptaciones/análisis adicionales de otros aislados de PV de roedor no caracterizados hasta ahora, pueden encontrarse en esta área variaciones adicionales.

Además de generar una variante H1-PV que es potencialmente capaz de propagarse de célula a célula en un tejido de tumor de glioblastoma humano y por consiguiente tiene un mayor potencial para destrucción de las células tumorales (como se indica por los ensayos de capacidad) , las partículas de la progenie de este aislado se transportan activamente a la periferia celular por vesículas. Además de viriones de síntesis nueva, se encontraron después de la infección proteínas celulares múltiples que estaban asociadas con tales vesículas y que no estaban presentes en las células de glioblastoma humano no infectadas. Este co-carga podría servir para desenmascarar células tumorales a fin de hacerlas disponibles para el sistema inmune del hospedador, contribuyendo con ello a una respuesta inmune antitumoral inducida por el virus.

1. Una variante H-1 de parvovirus de rata capaz de propagarse y extenderse en las células tumorales humanas, caracterizada por que los polipéptidos virales comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Figura 8B y que tienen una deleción desde la posición 587 a la 629 en el término C de NS1 y las sustituciones P124Q y E180K en NS1, una deleción desde la posición 95 a 136 en el exón medio de NS2 y la sustitución de aminoácido H374Y en VP1/VP2.

2. La variante H-1 de parvovirus de rata de la reivindicación 1, en la cual las células tumorales son células de glioma.

3. La variante H-1 de parvovirus de rata de la reivindicación 2, en la cual el glioma es un glioblastoma.

4. Un DNA, que codifica la variante H-1 de parvovirus de rata conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector de expresión, que comprende el DNA conforme a la reivindicación 4.

6. Una células hospedadora que contiene la variante H-1 de parvovirus de rata de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el vector de expresión conforme a la reivindicación 5.

7. Un anticuerpo, dirigido contra la proteína NS1 de una variante de parvovirus conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el mismo se fija solo a la proteína variante que tiene la deleción pero no a la proteína de tipo salvaje.

8. Kit que comprende:

(a) una variante de parvovirus de rata H-1 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

(b) un DNA conforme a la reivindicación 4;

(c) un anticuerpo conforme a la reivindicación 7; y/u, opcionalmente,

(d) agentes adyuvantes convencionales, tales como disolventes, tampones, portadores, marcadores y controles, en donde pueden estar presentes uno o más representantes de cada uno de los componentes (a) a (d) .

9. Una composición farmacéutica que contiene (a) una variante de parvovirus de rata H-1 conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el DNA de la reivindicación 4, el vector de expresión de la reivindicación 5, la célula hospedadora de la reivindicación 6 y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Uso de una variante de parvovirus de rata H-1 conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el DNA de la reivindicación 4, el vector de expresión de la reivindicación 5 o la célula hospedadora de la reivindicación 30 6 para la preparación de una composición farmacéuticamente para el tratamiento del cáncer.

11. La variante de parvovirus de rata H-1 conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el DNA de la reivindicación 4, el vector de expresión de la reivindicación 5 o la célula hospedadora de la reivindicación 6, para uso en el método de tratamiento del cáncer.

12. El uso de la reivindicación 10 ó 11, en el que dicho cáncer es un tumor cerebral.

13. El uso de la reivindicación 12, en el que dicho tumor cerebral es un glioma, meduloblastoma, meningioma o glioblastoma.