Nuevos complejos Tat, y vacunas que los comprenden.

Un complejo que comprende primer y segundo péptidos,

comprendiendo el primer péptido el bucle V3 de la gp120,

y en donde el bucle V3 está unido a una región de unión en el segundo péptido,

comprendiendo el segundo péptido dicha región de unión, región que comprende al menos los restos 21-40 y 46-58 de Tat (SEC ID NO 1), o al menos dichos restos con una mutación puntual adicional, con lo que Cys 22 de Tat es sustituido por glicina, siendo dicha Tat mutante en Cys22 capaz de unirse a una región en la gp120 que comprende los restos 301-419 de la gp120 (SEC ID NO. 2).

Nuevos complejos Tat, y vacunas que los comprenden

La presente Invención se refiere al uso de materiales proteicos que comprenden el bucle V3 de la gp120 en la fabricación de una vacuna contra virus que expresan la gp120.

La adsorción del VIH a la membrana de células diana se produce en el momento de la interacción de la gp120 de VIH con el receptor celular, CD4. Esta Interacción Induce una transición conformacional en la gp120, que causa la exposición del bucle V3 de la gp120. De acuerdo con un modelo propuesto, el bucle V3 de la gp120 interactúa, a su vez, con otras moléculas de la superficie celular que actúan como correceptores para el VIH. Los correceptores de VIH más Importantes son los receptores de qulmloclnas CCR5 y CXCR4. Actualmente está generalmente aceptado que el VIH macròfago-tròpico (M-trópico) aísla e Infecta macrófagos mediante CCR5, mientras que las cepas de VIH trópico por la línea de células T (TCL-trópIco) Infectan TCL mediante CXCR4, y cepas con doble tropismo infectan mediante cualquiera de los correceptores.

La Interacción del bucle V3 de la gp120 con los correceptores para VIH permite la formación de un complejo ternario entre el correceptor, CD4 y la gp120 que causa, a su vez, cambios conformacionales en la gp41. Junto con gp120, gp41 forma el complejo de glucoproteínas de la envuelta del virus (Env). Se cree que estos cambios conformacionales se requieren para dejar expuesta la secuencia de fusión en el extremo N de la gp41, que Interactúa con la superficie celular y causa la fusión entre la envuelta del virus y la membrana celular. En el transcurso de este mecanismo por etapas, epítopos crípticos en gp41 y gp120 quedan expuestos como resultado de la Interacción entre gp120 y CD4. Estos epítopos están, en caso contrario, ocultos y, en el caso de la gp120, son reconocidos por anticuerpos dirigidos contra la parte de la gp120 que interactúa con los correceptores.

Estos epítopos crípticos han sido objeto de intensa investigación para fines de vacunación e inmunización pasiva, y existen evidencias considerables de que el bucle V3 de la gp120 está implicado en el reconocimiento y el uso del correceptor. En particular: mutaciones o deleciones puntuales en V3 han demostrado abolir o cambiar el uso del correceptor; se ha demostrado que los péptidos de V3 interactúan con CXCR4; y anticuerpos contra V3 pueden alterar o bloquear la unión gp120-CCR5. Este modelo es, por lo tanto, generalmente aceptado, aunque diversas observaciones condujeron a la noción de que acontecimientos adicionales están implicados en utilización del correceptor, particularmente en macrófagos.

Tat es una proteina reguladora asociada con el virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1), producida muy pronto después de la infección, y que es esencial para la expresión gènica, la replicación y la infectividad del virus (Arya 1985; Fisher 1986; Chang 1995). Durante la infección aguda de células T por VIH, Tat también es liberada en el medio extracelular y captada por células vecinas (Frankel 1988; Ensoli 1990; Ensoli 1993; Chang 1997) donde, dependiendo de la concentración, el estado conformacional y el tipo celular, puede incrementar la infectividad del virus. Específicamente, la captación de Tat puede incrementar, en células infectadas, la expresión gènica y la replicación del virus (Frankel 1988; Ensoli 1993; Chang 1997), mientras que, en células no infectadas, incrementa la expresión de ambos correceptores CCR5 y CXCR4, favoreciendo la transmisión de cepas de VIH-1 con tropismo tanto por macrófagos como por linfocitos T (Huang 1998; Secchiero 1999).

Coherente con estos descubrimientos, la respuesta inmunitaria a Tat ha demostrado desempeñar un papel clave en el control de la evolución del SIDA y enfermedades asociadas al SIDA, y proteger a monos vacunados con Tat de infección por VISH (Cataro et al., Nat Med 1999). Sin embargo, no se ha reconocido o postulado nunca ningún papel específico de Tat en los acontecimientos moleculares que median la adsorción o fusión a la membrana del VIH, basándose en los estudios disponibles.

El documento WO 01/54719 desvela el uso de Tat y/o Nef, como antígenos, en forma de péptidos funcionales, inactivados, mutados o antigénicos, junto con Env de tipo silvestre, basándose en la observación de que la combinación de estos antígenos es útil para proteger a monos vacunados contra exposición con VIHS. La deñvatización de los antígenos a las formas antigénicas descritas los hace más seguros y/o más estables. No existe ninguna sugerencia de que se forme un complejo entre Tat o Nef, y Env.

Sorprendentemente, los inventores han descubierto que Tat puede interactuarcon el bucle V3 de la gp120, imitando de este modo al correceptor CCR5, a nivel tanto molecular (estructural) como funcional, otorgando de este modo a cepas de VIH CCR5-trópicas la capacidad de infectar células diana que expresan solamente cantidades muy bajas de CCR5, y que no resultarían infectadas con la misma entrada de virus, en ausencia de Tat inmovilizado.

Por lo tanto, en un primer aspecto, se proporciona un complejo que comprende primer y segundo péptidos, comprendiendo el primer péptido el bucle V3 de la gp120, y en el que el bucle V3 está unido a una región de unión en el segundo péptido,

comprendiendo el segundo péptido dicha región de unión, cuya región comprende al menos los restos 21-40 y 46- 58, de Tat (SEC ID NO 1), o al menos dichos restos con una mutación puntual adicional, con lo que Cys 22 de Tat

es sustituido por Glicina, siendo capaz dicha Tat mutante en Cys 22 de unirse a una región en gp120 que comprende los restos 301-419 de la gp120 (SEC ID NO. 2).

Preferentemente, la región de unión consta de al menos los restos 21-58 de la SEC ID NO 1. Preferentemente, los restos 21-48 y 46-60, o 46-58, de la SEC ID NO 1 están enlazados por un enlazador adecuado y están situados adecuadamente de modo que sean capaces de unirse a los restos 301-419 de la SEC ID NO. 2. Como alternativa, también se prefiere un único tramo contiguo que comprende 21-58 de la SEC ID NO 1, de nueva a condición de que la capacidad de unirse a los restos 301-419 de la SEC ID NO. 2 se conserve.

Preferentemente, la región de unión comprende al menos los restos 21-58 de la SEC ID NO 1. Como alternativa, también se prefiere que la región de unión comprenda al menos los restos 21 -40 y 46-58 de la SEC ID NO 1.

El complejo que comprende primer y segundo péptidos, comprendiendo el primer péptido el bucle V3 de la gp120, estando el bucle V3 disponible para coordinarse con una región de unión en el segundo péptido, siendo la región de unión derivada de Tat y siendo reconocible por un anticuerpo anti-CCR5, es útil en terapia, particularmente como componente inmunógeno en una vacuna.

Se entenderá que el término 'péptido' se usa en el presente documento para indicar una sustancia que tiene enlaces peptídicos o peptidomiméticos en su interior, y que puede ser parte de una molécula más grande que comprende otros tipos de compuesto, tales como restos de azúcar. Generalmente se prefiere que el péptido comprenda una mayoría de los aminoácidos de origen natural, y se prefiere particularmente que los aminoácidos de origen natural formen más del 90 % de los péptidos. En una realización preferida, los péptidos constan de péptidos de origen natural, opcionalmente sustituidos por grupos de bloqueo en cualquiera o ambos extremos y/o restos glucosídicos.

Es particularmente sorprendente que Tat sea capaz de unirse al bucle V3 de la gp120 y que, además, la región de Tat que se une al bucle V3 es reconocible por anticuerpos anti-CCR5. Dada la extremadamente alta especificidad de los anticuerpos monoclonales, es altamente probable que el efecto de Tat sobre el bucle V3 de la gp120 sea similar, o idéntico, al de CCR5. De hecho, los inventores han establecido que Tat extracelular es efectivamente capaz de proporcionar funcionalidad de CCR5 a células T que expresan cantidades muy bajas de este correceptor, al menos en la medida en que atañe a la infectividad por VIH.

Con respecto al documento WO 01/54719, por ejemplo, aunque Tat y Env pueden administrarse conjuntamente, Tat no es capaz de unirse al bucle V3 de Env en la preparación, dado que Env no ha sido activado por CD4, y dado que no se toman precauciones específicas para evitar la perturbación de la interacción del bucle V3 de Tat, tal como reticulación del complejo o adición del adyuvante solamente después de que el complejo esté formado. En el caso del documento WO 01/54719, en el momento en que Env es activado por CD4, ya no estará en las inmediaciones de Tat, de modo que la única ventaja a obtener de la administración conjunta es la ventaja... [Seguir leyendo]

1. Un complejo que comprende primer y segundo péptidos,

comprendiendo el primer péptido el bucle V3 de la gp120, y en donde el bucle V3 está unido a una región de unión en el segundo péptido,

comprendiendo el segundo péptido dicha región de unión, región que comprende al menos los restos 21-40 y 46-58 de Tat (SEC ID NO 1), o al menos dichos restos con una mutación puntual adicional, con lo que Cys 22 de Tat es sustituido por glicina, siendo dicha Tat mutante en Cys22 capaz de unirse a una región en la gp120 que comprende los restos 301-419 de la gp120 (SEC ID NO. 2).

2. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la región de unión comprende al menos los restos 21- 58 de la SEC ID NO 1 de la misma o dicha Tat mutante en Cys 22 que es capaz de unirse a los restos 301-419 de la SEC ID NO. 2.

3. Un complejo de acuerdo con las reivindicaciones Tat 1 o 2, preparado con Tat nativa.

4. Un complejo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el péptido que comprende el bucle V3 comprende un fragmento de la SEC ID NO 2 capaz de unirse a un péptido que consta de los restos 21-58 de la SEC ID NO 1.

5. Un complejo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el péptido que comprende el bucle V3 consta de la región del bucle V3 de la gp120.

6. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el péptido que comprende el bucle V3 comprende al menos los restos 301-419 de la SEC ID NO. 2.

7. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 6, que tiene toda o parte de la gp160 como componente del mismo, comprendiendo la gp160 al menos el bucle V3 de la gp120 y careciendo al menos de la mayor parte del bucle V2 de la gp120.

8. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 7, que tiene AV2Env como componente del mismo.

9. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además CD4 o un fragmento del mismo capaz de ¡nteractuar con Env para dejar expuesto un bucle V3 funcional.

10. Un complejo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende además un heparán sulfato.

11. Un complejo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende además una sustancia seleccionada entre integrinas, factor de crecimiento básico de fibroblastos, CD26, receptores de VEGF y receptores de quimiocinas.

12. Un complejo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que la región de unión está contenida dentro de un fragmento de Tat generable por proteasomas de células humanas al ser expuestas a Tat, en donde el fragmento de Tat se selecciona entre: fragmentos que contienen las regiones con cisterna, básica y RGD de Tat; fragmentos que contienen las regiones con cisterna y básica de Tat; fragmentos que contienen las regiones básica y RGD de Tat; y fragmentos que contienen la región básica de Tat, en solitario.

13. Un complejo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dichos péptidos están reticulados.

14. Un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para su uso como medicamento.

15. Un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una infección por VIH generando anticuerpos contra éste.

16. Un vehículo adecuado para inyección que comprende el complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

17. Uso de un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para establecer, ex vivo, si una muestra de un paciente contiene anticuerpos contra dicho complejo.