Mutantes de O-fosfoserina sulfhidrilasa y procedimiento de producción de cisteína usando los mismos.

Un mutante de la O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) de Mycobacterium smegmatis, que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 3.

Mutantes de O-fosfoserina sulfhidrilasa y procedimiento de producción de cisterna usando los mismos Campo técnico

La presente invención se refiere a un mutante de O-fosfoserina sulfhidrilasa (denominada también "OPSS") que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de Mycobacterium smegmatis que corresponde a la de las SEC ID N°: 3 o 4.

La presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de OPSS, un vector de expresión que porta la molécula de ácido nucleico, y un transformante transformado con el vector de expresión. Además, la presente invención concierne a un procedimiento producción de cisterna haciendo reaccionar O-fosfo-L-serina (OPS) con un sulfuro en presencia del mutante de OPSS.

Técnica anterior

La L-cisteína es un aminoácido que juega un papel importante en el metabolismo del azufre en todos los organismos vivos. Se usa en la biosíntesis de proteínas, tales como la queratina del cabello, glutatión, biotina, metionina, y otros metabolitos que contienen azufre y también sirve como precursor de la coenzima A. Además, se sabe que la biosíntesis de la cisterna se asocia estrechamente con la biosíntesis de otros aminoácidos incluyendo L-serina, L- glicina, y L-metionina. Industrialmente, la L-cisteína y sus derivados encuentran aplicaciones en una variedad de campos incluyendo la industria farmacéutica (para el tratamiento de enfermedades bronquiales), la industria cosmética (en champú para el cabello, composiciones para ondulados permanentes, etc.), y la industria alimentaria (antioxidantes, potenciadores del sabor, adyuvantes de la masa, etc.).

Tradicionalmente, la L-cisteína se obtenía industrialmente mediante hidrólisis ácida de cabello humano o plumas animales (Biotechnology of the Amino Acids Production editado por Ko Aida, páginas 217-223, 1986). Sin embargo, la producción de cisterna de cabello o plumas no solamente asegura un rendimiento tan bajo como del 7 - 8 %, sino que el uso de ácido clorhídrico o ácido sulfúrico produce una cantidad significativa de residuos contaminantes para el medio ambiente. Además, los consumidores pueden tener una fuerte aversión a la extracción de cabello o plumas. Estos problemas han ocasionado un impulso para el desarrollo de procesos de producción de L-cisteína respetuosos con el medio ambiente, conduciendo a la fermentación de L-cisteína utilizando microorganismos.

La conversión biológica de D, L-ATC usando un microorganismo es representativa de la producción microbiana de L- cisteína (Ryu OH, Ju JY, y Shin CS, Process Biochem., 32:201-209, 1997). Sin embargo, este proceso de conversión, es difícil de aplicar industrialmente debido a la baja solubilidad del precursor D, L-ATC. Otro proceso producción de L-cisteína es la fermentación directa usando E. coli (Patente N° EP 0885962B; Wada M y Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). La acumulación excesiva de L-cisteína en los microorganismos provoca toxicidad intracelular, dando como resultado la limitación para la producción de L-cisteína a una concentración alta. Para superar este inconveniente, se emplearon proteínas exportadoras de L-cisteína, sin embargo no hubo mejoras significativas de la productividad.

Con referencia a la ruta de la biosíntesis de la L-cisteína en bacterias y plantas, la O-acetil-serina (OAS) actúa como un precursor Intermediarlo que proporciona el esqueleto de carbono de la L-cisteína (Kredich NM y Tomkins GM, J. Biol. Chem., 241: 4955-4965, 1966). La enzima O-acetilserina sulfhidrilasa (OASS), que usa sulfuro de hidrógeno como donante se azufre, cataliza la conversión de O-acetilserina a S-sulfocisteína y finalmente a cisteína, liberando acetato. Como alternativa, el S04 puede reducirse a tiosulfato para usarse como donante de azufre en la producción de cisteína (Nakamura T, Kon Y, Iwahashi H, y Eguchi Y, J. Bacteriol., 156: 656-662, 1983). La ruta de la biosíntesis de cisteína por medio de OAS usa las dos enzimas de la serina acetil-transferasa (CysE), que cataliza la conversión de serina a OAS, y cisteína sintasa (CysK), que cataliza la conversión de OAS a cisteína. Cabe destacar que entre ellas la serina acetiltransferasa (CysE) es altamente sensible a la inhibición por retroalimentación mediante de la cisteína del producto final (Wada M y Tagaki H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). Por lo tanto, es necesaria una enzima alterada que sea insensible a la inhibición por retroalimentación, sin embargo esta es difícil de desarrollar.

Divulgación

Problema técnico

Dirigiendo la presente invención, la investigación intensiva y minuciosa en la producción de L-cisteína a un alto rendimiento realizada por los presentes inventores destinada a superar los problemas encontrados en la técnica anterior, dio como resultado el hallazgo de que existe O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) en Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, y Trichomonas vaginalis que toma una ruta específica de la O-fosfo-L-serina (OPS), en lugar de la ruta específica de OAS, para sintetizar L-cisteína (Mino K e Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW, y Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602- 11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC, y Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006) y que la OPSS de M. tuberculosis, que cataliza la conversión de OPS a cisteína con las enzimas adicionales mec+ y cysO,

puede usar Na2S como donante de azufre en la conversión de OPS a cisterna incluso en ausencia de las enzimas adicionales cuando los cinco restos de aminoácidos del extremo C-terminal se eliminan de la misma (Agren D, Schnell R y Schneider G, FEBS letters, 583: 330-336, 2009).

Solución técnica

Es por lo tanto un objeto de la presente invención proporcionar un mutante de O-fosfoserina sulfhidrilasa (también denominada "OPSS") que tenga una secuencia de aminoácidos derivada de Mycobacterium smegmatis que consiste en las SEC ID N°: 3 o 4.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de OPSS.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un vector de expresión que porta la molécula de ácido nucleico.

Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar un transformante transformado con el vector de expresión.

Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar un procedimiento para la conversión de O-fosfo-L- serina en cisterna con un sulfuro en presencia del mutante de OPSS.

Efectos ventajosos

Como se ha descrito anteriormente, el mutante de OPSS con actividad enzimática mejorada que es esencial para la conversión enzimática de la O-fosfoserina en L-cisteína, puede usarse para producir L-cisteína a partir de OPS a escala masiva a un alto rendimiento de un modo sencillo.

Descripción de las figuras

La FIG. 1 es una gráfica que muestra la actividad de la OPSS de acuerdo con la temperatura.

La FIG. 2 es un conjunto de gráficas que muestran la sensibilidad al pH de la OPSS.

La FIG. 3 es una fotografía que muestra el nivel de expresión de la enzima en un sistema pET y un sistema pCL-Pcj1 como se analizó por SDS PAGE.

La FIG.4 es una gráfica que muestra la actividad enzimática de OPSS para convertir caldo de fermentación de OPS en cisterna.

La FIG. 5 es una gráfica que muestra la actividad enzimática de OPSS para convertir caldo de fermentación de OPS en cisteína.

La FIG. 6 es una gráfica que muestra la producción de OPS y cisteína que se convierte mediante la OPSS usando OPS como un sustrato a una escala de un frasco de 1 I.

La FIG. 7 es una vista esquemática que muestra el mapa de un vector de expresión pCL-Pcj1 que porta un gen que codifica un mutante de OPSS.

Mejor modo

La presente divulgación proporciona un mutante de OPSS derivado de Mycobacterium smegmatics con la misma secuencia de aminoácidos que la de SEC ID N°: 1, con la excepción de carecer de 3 a 7 restos de aminoácidos del extremo C-terminal de la secuencia aminoácidos de la O-fosfoserina sulfhidrilasa de tipo silvestre.

En una realización de la presente divulgación, el mutante de OPSS de la presente invención puede tener una de las secuencias de aminoácidos como las de las SEC ID N°: 2, 3, y 4. El mutante de OPSS que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 2 puede modificarse adicionalmente para tener una sustitución del resto de prolina (Pro) en la posición 77 con un resto de serina (Ser). Además, el mutante de OPSS que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 2 puede modificarse adicionalmente para tener una sustitución del resto de treonina... [Seguir leyendo]

1. Un mutante de la O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) de Mycobacterium smegmatis, que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 3.

2. Un mutante de la O-fosfoserina sulfhidrilasa (OPSS) de Mycobacterium smegmatis, que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 4.

3. El mutante de OPSS de las reivindicaciones 1 o 2, que muestra actividad óptima en condiciones que comprenden:

i) la adición de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 2 mM de PLP (piridoxal-5-fosfato) o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mM de DTT (ditiotreitol) como un cofactor;

¡i) un intervalo de temperatura de reacción de 25 ~ 60 °C; y iii) un intervalo de pH de 6,0 ~ 10,0.

4. Una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de OPSS como en una de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector de expresión que porta una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de OPSS como en una de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Un transformante transformado con el vector de expresión de la reivindicación 5.

7. Un procedimiento de producción de cisterna que comprende hacer reaccionar O-fosfo-L-serina (OPS) con sulfuras en presencia del mutante de OPSS como en una de las reivindicaciones 1 a 3.

8. El procedimiento de producción de cisterna de la reivindicación 7, en el que la OPS está en una forma purificada o en una forma de cultivo de fermentación que contiene OPS.

9. El procedimiento de producción de cisteína de la reivindicación 7, que comprende un sulfuro seleccionado del grupo que consiste en: Na2S, NaSH, (NH^SH, H2S, y S203, estando todos ellos en estado gaseoso o líquido.

10. El procedimiento de producción de cisteína de la reivindicación 7, en el que el sulfuro es usado en una cantidad de 0,1 ~3 veces respecto una concentración molar de OPS.

11. El uso del mutante de OPSS como en una de las reivindicaciones 1 a 3 en la biosíntesis de cisteína a partir de OPS.