Moléculas de una sola cadena de TNFSF.

Un polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende:

(i) un primer dominio de citoquinas de la familia de TNF soluble,

(ii) un primer enlazador peptídico,

(iii) un segundo dominio de citoquinas de la familia TNF soluble,

(iv) un segundo enlazador peptídico, y

(v) un tercer dominio de citoquinas de la familia TNF soluble,

en donde el polipéptido de fusión es sustancialmente no-agregante, en donde el dominio de citoquinas de la familia TNF soluble se selecciona de dominios TRAIL.

Moléculas de una sola cadena de TNFSF

La presente invención se refiere a proteínas de fusión de una sola cadena que comprenden tres dominios de citoquinas de la superfamilia del TNF soluble (TNFSF) y moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión. Las proteínas de fusión son sustancialmente no agregantes y son adecuadas para aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o de investigación.

Estado de la Técnica Se sabe que se requiere una trimerización de citoquinas de TNFSF, p. ej., el ligando CD95 (CD95L) , para una unión y activación eficaces del receptor. Complejos triméricos de citoquinas de la superfamilia del TNF, sin embargo, son difíciles de preparar a partir de unidades monoméricas recombinantes.

Los documentos WO 01/49866 y WO 02/09055 describen proteínas de fusión recombinantes que comprenden una citoquina TNF y un componente de multimerización, en particular una proteína de la familia de proteínas C1q o una colectina. Una desventaja de estas proteínas de fusión es, sin embargo, que el dominio de trimerización tiene habitualmente un gran peso molecular y/o que la trimerización es bastante ineficiente.

Schneider et al. (J Exp Med 187 (1989) , 1205-1213) describen que trímeros de citoquinas TNF se estabilizan por motivos de estabilización situados en posición N-terminal. En CD95L, la estabilización del trímero del dominio de unión al receptor es presumiblemente provocada por dominios de aminoácidos N-terminales que están situados cerca de la membrana citoplasmática.

Shiraishi et al. (Biochem Biophys Res Commun 322 (2004) , 197-202) describen que el dominio de unión al receptor de CD95L puede ser estabilizado por motivos enrollados en espiral -helicoidal (cremallera de leucina) artificiales situados en posición N-terminal. Se encontró, sin embargo, que apenas se puede predecir la orientación de las cadenas de polipéptidos entre sí, p. ej., orientación paralela o antiparalela. Además, el número óptimo de repeticiones heptad en el motivo de cremallera enrollado en espiral son difíciles de determinar. Además, las estructuras enrolladas en espiral tienen la tendencia a formar agregados macromoleculares después de la alteración del pH y/o la fuerza iónica.

WO 01/25277 se refiere a polipéptidos oligoméricos de cadena sencilla que se unen a un dominio de unión a ligando extracelular de un receptor celular, en donde el polipéptido comprende al menos tres sitios de unión al receptor de los cuales al menos uno es capaz de unirse a un dominio de unión a ligando del receptor celular y al menos uno es incapaz de unirse con eficacia a un dominio de unión a ligando del receptor celular, por lo cual los polipéptidos oligoméricos de cadena sencilla son capaces de unirse al receptor, pero son incapaces de activar el receptor. Por ejemplo, los monómeros se derivan de ligandos de citoquinas de la familia de TNF, en particular de TNF-.

El documento WO 2005/103077 describe polipéptidos de fusión de cadena sencilla que comprenden al menos tres monómeros de un miembro de ligando de la familia de TNF y al menos dos conectores peptídicos que unen entre sí los monómeros de los miembros de la familia de ligandos de TNF. Experimentos recientes, sin embargo, han demostrado que estos polipéptidos de fusión de cadena sencilla muestran una agregación no deseada.

Era un objeto de la presente invención proporcionar proteínas de fusión de cadena sencilla que comprendan al menos tres dominios de citoquinas TNF que permitan la fabricación recombinante eficiente combinada con una buena estabilidad relativa a la agregación.

Compendio de la Invención La presente invención se refiere a un polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende:

(i) un primer dominio de citoquinas de la familia de TNF soluble,

(ii) un primer enlazador peptídico,

(iii) un segundo dominio de citoquinas de la familia TNF soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico, y

(v) un tercer dominio de citoquinas de la familia TNF soluble que es sustancialmente no-agregante, en donde el dominio de citoquinas de la familia TNF soluble se selecciona de dominios TRAIL. La invención se refiere, además, a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según se describe en esta memoria y a una célula o un organismo no humano transformado o transfectado 5 con una molécula de ácido nucleico según se describe en esta memoria. La invención se refiere también a una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende como agente activo una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, o una célula según se describe en esta memoria. La invención también se refiere a una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico o una célula según se describe en esta memoria para su uso en terapia, p. ej., el uso de una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, o una célula según se describe en 10 esta memoria para la preparación de una composición farmacéutica en la profilaxis y/o tratamiento de trastornos causados por, asociados con y/o acompañados de la disfunción de citoquinas de TNFSF, en particular trastornos proliferativos tales como tumores, p. ej., tumores sólidos o linfáticos; enfermedades infecciosas; enfermedades inflamatorias; enfermedades metabólicas; trastornos autoinmunes, p. ej., enfermedades reumatoides y/o artríticas; enfermedades degenerativas, p. ej., enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis múltiple; enfermedades asociadas a la apoptosis o rechazos de trasplantes.

Descripción de las Figuras Figura 1 Estructura del dominio del polipéptido de fusión de cadena sencilla de la invención. I., II., III. dominios de citoquinas de la familia de TNF solubles.

Figura 2 Imagen esquemática que representa la estructura general de proteínas de la TNF-SF. 20 membrana celular, extremo N situado dentro de la célula, 1. Pliegue ß anti-paralelo del dominio de unión al receptor (RBD) , 2. Interfaz de RBD y membrana celular, 3 sitio de escisión de proteasa.

Figura 3 Imagen esquemática que representa la estructura del trímero de la TNF-SF nativo. Las estructuras cilíndricas representan RBDs, Los extremos N conectan RBD con la membrana celular.

Figura 4 Imagen esquemática que representa la estructura de tres dominios solubles que comprenden el 25 dominio de unión al receptor de una citoquina TNF. I., II., III. dominios de citoquinas de la familia TNF solubles.

Figura 5 Trimerización de los dominios solubles que comprenden el RBD de una citoquina TNF, caracterizado porque los extremos N y C de los tres dominios solubles forman una superficie.

Figura 6 Imagen esquemática que representa la estructura de la TNF-SF de una sola cadena que 30 comprende toda o una parte de la región de tallo que ilustra el requisito de enlazadores más largos para compensar la distancia al extremo N del siguiente dominio soluble.

Figura 7 Proteína de fusión scFv-TNF-SF conocida de la técnica.

Figura 8 Proteína de fusión Fc-TNF-SF conocida de la técnica.

Figura 9 9A Polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende un fragmento adicional de anticuerpo 35 Fab. 9B Polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende un fragmento adicional de anticuerpo scFv.

Figura 10 Dimerización de dos polipéptidos de fusión ScFc fusionados de forma N-terminal a través de puentes disulfuro.

Figura 11 Dimerización de dos polipéptidos de fusión ScFc fusionados de forma C-terminal a través de 40 puentes disulfuro.

Figura 12 Dimerización de polipéptidos de fusión de cadena sencilla a través de un enlazador.

Figura 13 Polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende un fragmento de anticuerpo Fab adicional fusionado adicionalmente a un segundo polipéptido de fusión o a un polipéptido de fusión scFv.

Figura 14 Dimerización de dos polipéptidos de fusión scFab a través de puentes disulfuro.

Figura 15 Polipéptidos de fusión ScFc fusionados de forma N-terminal que comprenden adicionalmente un fragmento de anticuerpo Fv y/o Fab.

Figura 16 Polipéptidos de fusión ScFc fusionados de forma C-terminal que comprenden adicionalmente un fragmento de anticuerpo Fv y/o Fab.

10 Figura 17 Análisis SEC de miembros de la TNF-SF expresados de manera recombinante, purificados, en condiciones nativas. Se muestran a modo de ejemplo dos análisis SEC de los miembros de la TNF-SF purificados en una columna Superdex200 bajo condiciones nativas (p. ej.: PBS, pH 7, 4) . Los diagramas muestran la absorción a 280 nm (mAU) representada frente al volumen de elución (ml) . La flecha en negro indica el pico de elución para la fracción que contiene proteína laq TNF-SF trimérica... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende:

(i) un primer dominio de citoquinas de la familia de TNF soluble,

(ii) un primer enlazador peptídico,

(iii) un segundo dominio de citoquinas de la familia TNF soluble,

(iv) un segundo enlazador peptídico, y

(v) un tercer dominio de citoquinas de la familia TNF soluble,

en donde el polipéptido de fusión es sustancialmente no-agregante, en donde el dominio de citoquinas de la familia TNF soluble se selecciona de dominios TRAIL.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el segundo y/o el tercer dominio de citoquinas de la familia TNF soluble, es un dominio acortado de modo N-terminal, que opcionalmente comprende mutaciones en las secuencias de aminoácidos.

3. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde al menos uno de los dominios de citoquinas de la familia TNF soluble, particularmente al menos uno de los dominios (iii) y (v) de citoquinas de la familia TNF soluble es un dominio soluble TRAIL, con una secuencia que comienza entre el aminoácido Gln120 y Val122 de TRAIL humano, y en donde Arg121 puede ser reemplazado por un aminoácido neutro, p. ej., Ser o Gly.

4. El polipéptido de la reivindicación 3, en donde al menos uno de los dominios de citoquinas de la familia TNF soluble, particularmente al menos uno de los dominios (iii) y (v) de citoquinas de la familia TNF soluble es un dominio soluble TRAIL con una secuencia N-terminal seleccionada de

(a) Arg121 - Val122 - Ala123 y

(b) (Gly/Ser) 121 - Val122 - Ala 123.

5. El polipéptido de las reivindicaciones 3 ó 4, en donde el dominio soluble TRAIL termina con el aminoácido Gly281 de TRAIL humano y/o comprende opcionalmente una mutación en las posiciones R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, I266, D267 o D269 o en dos o más de dichas posiciones.

6. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el primer y segundo enlazadores peptídicos, independientemente, tienen una longitud de de 3-8 aminoácidos, particularmente una longitud de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos, y preferiblemente son enlazadores de glicina/serina que comprenden opcionalmente un residuo asparagina que puede estar glicosilado.

7. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que adicionalmente comprende un dominio de péptido señal N-terminal, que puede comprender un sitio de escisión de proteasa, y/o que adicionalmente comprende un elemento C-terminal que puede comprender y/o conectarse a un dominio de reconocimiento/purificación.

8. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que adicionalmente comprende en posición Nterminal y/o C-terminal un dominio adicional, p. ej., un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cadena sencilla tal como un dominio Fab o de fragmento Fc.

9. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 18, preferiblemente en enlace operativo con una secuencia del control de la expresión.

10. Una célula o un organismo no humano, transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9, en donde la célula es, p. ej., una célula procariota o una célula eucariota, preferiblemente una célula de mamífero, o más preferiblemente una célula humana.

11. Una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende, como agente activo, una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9, particularmente para uso en terapia, más particularmente para la profilaxis y/o tratamiento de trastornos causados por, asociados con y/o acompañados de la disfunción de citoquinas TNF, en particular trastornos proliferativos tales como tumores,

p. ej., tumores sólidos o linfáticos; enfermedades infecciosas; enfermedades inflamatorias; enfermedades 87

metabólicas; trastornos autoinmunes, p. ej., enfermedades reumatoides y/o artríticas; enfermedades degenerativas, p. ej., enfermedades neurodegenerativas tales como la esclerosis múltiple; enfermedades asociadas a la apoptosis o rechazos de trasplantes.