Molécula de ácido nucleico monocatenario para controlar la expresión génica.

Una molécula de ARN monocatenario que comprende solamente una secuencia inhibidora de la expresión que inhibe la expresión de un gen diana,

donde:

- la molécula comprende, en secuencia, desde un lado 5' a un lado 3': una región en el lado 5' (Xc); una región interna (Z) que comprende la secuencia inhibidora de la expresión y que está compuesta por una región interna en el lado 5' (X) y una región interna en el lado 3' (Y) que están unidas entre sí; y una región en el lado 3' (Yc);

- la región del lado 5' (Xc) es complementaria de la región interna del lado 5' (X);

- la región del lado 3' (Yc) es complementaria de la región interna del lado 3' (Y);

- la región del lado 5' (Xc) y la región interna del lado 5' (X) están unidas entre sí mediante una región enlazadora (Lx) que no se autohibrida consigo misma;

- la región del lado 3' (Yc) y la región interna del lado 3' (Y) están unidas entre sí a una región enlazadora (Ly) que no se autohibrida consigo misma;

- el número de bases (Z) de la región interna (Z), el número de bases (X) de la región interna del lado 5' (X), el número de bases (Y) en la región interna del lado 3' (Y), el número de bases (Xc) en la región interna del lado 5' (Xc) y el número de bases (Yc) en la región del lado 3' (Yc) satisfacen preferentemente las siguientes condiciones: Z ≥ X + Y;

Z >Xc + Yc;

Z≥ 19 a 30;

Xc ≥ 1 a 7 o Yc ≥ 1 a 9;

y

Z - (Xc + Yc) ≥ 0 o 1 a 10;

y el número bases en cada una de las regiones enlazadoras (Lx) y (Ly) es de 3 a 50.

Molécula de ácido nucleico monocatenario para controlar la expresión génica Campo técnico

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico monocatenario que inhibe la expresión génica, a una composición que contiene la molécula de ácido nucleico monocatenario, y al uso de la molécula de ácido nucleico monocatenario.

Antecedentes de la técnica

Se conoce la interferencia del ARN (ARNi) como técnica para inhibir la expresión génica, por ejemplo (Fire et al, Nature, vol. 391, 806-811, 1998). La inhibición de la expresión génica se suele llevara cabo mediante la interferencia del ARN administrando una molécula de un ARN bicatenario corto a una célula o similar, por ejemplo. La molécula de ARN bicatenario se denomina normalmente ARNip (ARN interferente pequeño). Se ha notificado que no solo la molécula del ARNip sino también una molécula de ARN circular que se vuelve parcialmente bicatenaria mediante hibridación intermolecular puede inhibir también la expresión génica (JP 2008-278784 A). Sin embargo, las moléculas de ARN utilizadas en estas técnicas para inducir la inhibición de la expresión génica tienen los siguientes problemas.

En primer lugar, para producir el ARNip, es necesario sintetizar una cadena de sentido directo y una cadena de sentido contrario por separado e hibridar estas cadenas al final del proceso. De esta manera, existe un problema de baja eficacia de fabricación. Además, cuando se administra el ARNip a una célula, es necesario administrar el ARNip a la célula a la vez que se reprime la disociación de los ARN monocatenarios, lo que requiere una laboriosa tarea de ajuste de las condiciones para manipular el ARNip. Por otra parte, la molécula de ARN circular tiene el problema de que su síntesis es difícil.

Yu et al, PNAS vol 99, n° 9, 6047-6052, 2002 notifica la interferencia del ARN mediante la expresión de ARN interferentes cortos y de ARN en horquilla en células de mamíferos. Paddison et al, Genes & Development vol 16, n° 8, 948-958, 2002 notifica que los ARN de horquilla corta (ARNhc) inducen un silenciamiento específico de secuencia en células de mamíferos: McAnuff et al, J. Pharmaceutical Sciences vol 96, n° 11.2922-2930, 2007 compara la potencia de la desactivación in vivo mediada por ARNip comparada con la de ARNhc in vivo.

El documento US 2002/0156261 A1 describe oligonucleótidos que pueden modificar o inhibir la expresión in vivo o in vitro de un gen diana donde el oligonucleótido tiene una secuencia de sentido contrario, al menos una estructura secundaria, y opcionalmente una secuencia de nucleótidos suplementaria localizada en uno y/o ambos extremos de la secuencia de sentido contrario y donde la estructura secundaria se desintegra tras la unión del oligonucleótido a un ácido nucleico diana.

El documento EP 1669450 A1 se refiere a los denominados oligonucleótidos "esenciales" para uso como medicamentos. Los oligonucleótidos esenciales son monocatenarios y comprenden una secuencia en el extremo 5', y una secuencia intermedia y una secuencia en el extremo 3'. La secuencia en el extremo 5' tiene una complementariedad inversa con la secuencia intermedia. La secuencia en el extremo 3' tiene una complementariedad inversa con la secuencia intermedia. La secuencia intermedia tiene bucles de 3 a 10 nucleótidos en ambos extremos. Cada bucle no forma un enlace complementario intramolecularmente.

El documento WO 2009/076321 describe moléculas de ácido nucleico que incluyen una región complementaria de un gen diana y una o más regiones autocomplementarias. Dichos ácidos nucleicos se usan para modular la expresión génica y tratar una variedad de enfermedades e inflexiones.

Breve sumario de la invención

Recordando lo anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar una molécula de ARN novedosa que pueda inhibir la expresión génica y pueda producirse fácil y eficazmente.

Para conseguir el objeto anterior, la presente invención proporciona una molécula de ARN monocatenario que comprende solo una secuencia inhibidora de la expresión que inhibe la expresión de un gen diana, donde:

- la molécula comprende, en secuencia, desde un lado 5' a un lado 3': una región en el lado 5' (Xc); una región interna (Z) que comprende la secuencia inhibidora de la expresión y que está compuesta por una región interna en el lado 5' (X) y una región interna en el lado 3 (Y) que están unidas entre sí; y una región en el lado 3' (Ye);

- la región del lado 5' (Xc) es complementaria de la región interna del lado 5' (X);

- la región del lado 3' (Ye) es complementaria de la región interna del lado 3' (Y);

- la región del lado 5' (Xc) y la región interna del lado 5' (X) están unidas entre sí mediante una región enlazadora (Lx)

que no se autohibrida consigo misma;

- la región del lado 3' (Ye) y la región interna del lado 3' (Y) están unidas entre sí a una región enlazadora (Ly) que no se autohibrida consigo misma;

- el número de bases (Z) de la región interna (Z), el número de bases (X) de la región interna del lado 5' (X), el

número de bases (Y) de la región interna del lado 3' (Y), el número de bases (Xc) de la región del lado 5 (Xc) y el

número de bases (Ye) en la región del lado 3 (Ye) satisfacen las siguientes condiciones:

Z = X + Y;

Z > Xc + Ye;

Z= 19 a 30;

Xc = 1 a 7 o Ye = 1 a 9;

Z - (Xc + Ye) = 0 o 1 a 10;

y

- el número bases en cada una de las regiones enlazadoras (Lx) y (Ly) es de 3 a 50.

La presente invención proporciona también una composición para inhibirla expresión de un gen diana. La composición contiene la molécula de ARN monocatenario de acuerdo con la presente invención.

La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que contiene la molécula de ARN de acuerdo con la presente invención.

La presente invención proporciona también:

- un método in vitro para inhibir la expresión de un gen diana, donde la molécula de ARN monocatenario de acuerdo con la presente invención se usa y administra a una célula, un tejido o un órgano; y

- un método in vitro para inducir la interferencia del ARN que inhibe la expresión de un gen diana, comprendiendo el método utilizar la molécula de ARN monocatenario de acuerdo con la presente invención.

La presente invención proporciona también una molécula de ARN para su uso en un método para tratar una enfermedad, donde:

- la molécula de ARN es la molécula de ARN monocatenario de acuerdo con la presente invención, y

- la molécula de ARN monocatenario incluye, como secuencia inhibidora de la expresión, una secuencia que inhibe la expresión de un gen que produce la enfermedad.

Utilizando la molécula de ARN monocatenario de la presente invención, es posible inhibir la expresión génica. Además, puesto que la molécula de ARN monocatenaria no es circular, se puede sintetizar fácilmente. Asimismo, puesto que se trata de una sola cadena, no es necesaria una etapa de hibridación como la que se requiere en la producción de una cadena doble, por lo tanto se puede producir eficazmente.

Son los inventores de la presente invención los que han descubierto en primer lugar que la expresión génica puede inhibirse de acuerdo con la estructura de la molécula de ARN monocatenario de la presente invención. Se especula que el efecto inhibidor del gen de la molécula de ARN monocatenario de la presente invención está producido por un fenómeno similar a la interferencia del ARN. Debe señalarse, sin embargo, que la inhibición de la expresión génica en la presente invención no está limitada o restringida a la interferencia del ARN.

Breve descripción de los dibujos

[FIG. 1] La FIG. 1 muestra vistas esquemáticas que ilustran un ejemplo de la molécula de ARN monocatenario (no de la presente invención).

[FIG. 2] La FIG. 2 muestra vistas esquemáticas que ilustran otros ejemplos de la molécula de ARN monocatenario de la presente invención.

[FIG. 3] La FIG. 3 muestra vistas esquemáticas que ilustran otros ejemplos de la molécula de ARN monocatenario de la presente invención.

[FIG. 4] La FIG. 4 es una gráfica que muestra el nivel de expresión relativa del gen GAPDH en un ejemplo de la presente invención.

[FIG. 5] La FIG. 5 es una gráfica que muestra el nivel de expresión relativa del gen GAPDH en otro ejemplo de la presente invención.

[FIG. 6] La FIG. 6 es una gráfica que muestra el nivel de expresión relativa del gen GAPDH en células A549 en otro ejemplo más de la presente invención

[FIG. 7] La FIG. 7 es una gráfica que muestra el nivel... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ARN monocatenario que comprende solamente una secuencia inhibidora de la expresión que inhibe la expresión de un gen diana, donde:

- la molécula comprende, en secuencia, desde un lado 5' a un lado 3': una región en el lado 5' (Xc); una región

interna (Z) que comprende la secuencia inhibidora de la expresión y que está compuesta por una región interna en el lado 5' (X) y una región interna en el lado 3 (Y) que están unidas entre sí; y una región en el lado 3' (Ye);

- la región del lado 5' (Xc) es complementaria de la región interna del lado 5' (X);

- la región del lado 3' (Ye) es complementaria de la región interna del lado 3' (Y);

- la región del lado 5' (Xc) y la región interna del lado 5' (X) están unidas entre sí mediante una región enlazadora

(Lx) que no se autohibrida consigo misma;

- la región del lado 3' (Ye) y la región interna del lado 3' (Y) están unidas entre sí a una región enlazadora (Ly) que no se autohibrida consigo misma;

- el número de bases (Z) de la región interna (Z), el número de bases (X) de la región interna del lado 5' (X), el número de bases (Y) en la región interna del lado 3' (Y), el número de bases (Xc) en la región interna del lado 5' (Xc) y el número de bases (Ye) en la región del lado 3' (Ye) satisfacen preferentemente las siguientes condiciones:

Z = X + Y;

Z > Xc + Ye;

Z= 19 a 30;

Xc = 1 a 7 o Ye = 1 a 9;

y

Z - (Xc + Ye) = 0 o 1 a 10;

y

- el número bases en cada una de las regiones enlazadoras (Lx) y (Ly) es de 3 a 50.

2. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con la reivindicación 1, donde el número bases en cada una de las regiones enlazadoras (Lx) y (Ly) es de hasta 30.

3. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde

el número de bases (X) de la región interna del lado 5' (X), el número de bases (Xc) en la región del lado 5' (Xc), el número de bases (Y) en la región interna del lado 3' (Y) y el número de bases (Ye) en la región interna del lado 3' (Ye) satisfacen cualquiera de las siguientes condiciones (a) a (d):

(a) se satisfacen las condiciones de las expresiones (3) y (4):

X>Xc...(3)

Y = Yc...(4)

(b) se satisfacen las condiciones de las expresiones (5) y (6):

X = Xc...(5)

Y > Yc...(6)

(c) se satisfacen las condiciones de las expresiones (7) y (8):

X> Xc...(7)

Y > Yc...(8)

(d) se satisfacen las condiciones de las expresiones (9) y (10):

X = Xc...(9)

Y = Ye...(10).

4. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con la reivindicación 3, donde, en las condiciones (a) a (d), la diferencia entre el número de bases (X) en la reglón Interna del lado 5 (X) y el número de bases (Xc) en la región del lado 5 (Xc) y la diferencia entre el número de bases (Y) en la región Interna del lado 3 (Y) y el número de bases (Ye) en la reglón del lado 3 (Ye) satisface las siguientes condiciones:

(a) se satisfacen las condiciones de las expresiones (11) y (12):

X-Xc-1,2o3...(11)

Y - Ye = 0...(12)

(b) se satisfacen las condiciones de las expresiones (13) y (14):

X - Xc = 0...(13)

Y-Yc=1,2o3...(14)

(c) se satisfacen las condiciones de las expresiones (15) y (16):

X- Xc = 1, 2 o 3...(15)

Y-Yc=1,2o3...(16)

(d) se satisfacen las condiciones de las expresiones (17) y (18):

X - Xc = 0...(17)

Y - Ye = 0...(18).

5. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:

- el número de bases Z - (Xc + Ye) es 1 a 4; o

- el número de bases (Xc) en la región del lado 5 (Xc) es 1 a 11; o

- el número de bases (Ye) en la región del lado 3 (Ye) es 1 a 11.

6. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con la reivindicación 5, donde:

- el número de bases Z - (Xc + Ye) es 1, 2 o 3; o

- el número de bases (Xc) en la región del lado 5 (Xc) es 1 a 7; o

- el número de bases (Y) en la región del lado 3 (Ye) es 1 a 7.

7. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con la reivindicación 6, donde:

- el número de bases (Xc) en la región del lado 5 (Xc) es 1 a 3; o

- el número de bases (Ye) en la región del lado 3 (Ye) es 1 a 3.

8. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos un resto modificado,

y/o

que comprende además una sustancia marcadora, y/o que comprende además un isótopo estable.

9. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la región enlazadora (Lx) y/o la región enlazadora (Ly) está compuesta por restos de nucleótidos sin modificar.

10. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la región enlazadora (Lx) y/o la región enlazador (Ly) está compuesta por restos de nucleótidos modificados.

11. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la región enlazadora (Lx) y/o la región enlazadora (Ly) está compuesta por restos de nucleótidos sin modificar y restos de nucleótidos modificados.

12. La molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde:

- el número total de bases en la molécula de ARN monocatenario es de 50 o más; y/o

- la secuencia de bases de la molécula de ácido nucleico monocatenario es cualquiera de las SEC ID N"5: 2, 7, 8,

13, 14, 29 a 35, 37, 43, 44, 47, 48, y 51 a 80.

13. Una composición para inhibir la expresión de un gen diana, comprendiendo la composición la molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

14. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, para su uso en un método de tratamiento de la inflamación.

16. Un método in vitro para inhibir la expresión de un gen diana, comprendiendo el método:

- utilizar la molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y

- administrar la molécula de ARN monocatenario a una célula, un tejido, o un órgano.

17. Un método in vitro para inducir la interferencia del ARN que inhibe la expresión de un gen diana, comprendiendo el método:

- utilizar la molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

18. una molécula de ARN para el uso en un método de tratamiento de una enfermedad, donde

- la molécula de ARN es la molécula de ARN monocatenario de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y

- la molécula de ARN monocatenario comprende, como secuencia inhibidora de la expresión, una secuencia que inhibe la expresión de un gen que produce la enfermedad.