Microorganismo con capacidad para producir compuestos que inducen respuesta sistémica en plantas y sus aplicaciones como promotor del crecimiento vegetal.

Microorganismo con capacidad para producir compuestos que inducen respuesta sistémica en plantas y sus aplicaciones como promotor del crecimiento vegetal.

Se describe un microorganismo de la especie Pseudomonas fluorescens que induce la producción de compuestos que inducen resistencia sistémica en plantas así como la producción de compuestos estimuladores del crecimiento de las plantas y que, además, solubiliza fosfatos insolubles y hierro. Ventajosamente, dicho microorganismo sobreproduce aminoácidos. Dicho microorganismo puede utilizarse en agricultura, como fitofortificante, bioactivador y como agente para incrementar la resistencia de las plantas a agentes fitopatógenos.

MICROORGANISMO CON CAPACIDAD PARA PRODUCIR COMPUESTOS QUE INDUCEN RESPUESTA SISTÉMICA EN PLANTAS Y SUS APLICACIONES COMO PROMOTOR DEL CRECIMIENTO VEGETAL

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona con un microorganismo de la especie Pseudomonas fíuorescens con capacidad para producir compuestos que inducen resistencia sistémica en plantas e incrementan la resistencia de la planta frente a estreses ambientales y frente a agentes fitopatógenos, así como compuestos estimuladores del crecimiento de las plantas, y, además, solubilizar fosfatos insolubles y hierro. El microorganismo de la invención, ha sido seleccionado por su capacidad para facilitar la nutrición orgánica de las plantas y encuentra aplicación en el campo de la agricultura, en particular, como fitofortificante, bioactivador y como agente para incrementar la resistencia de las plantas a agentes biológicos que puedan generar daño.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Debido al creciente interés en productos biológicos, no sólo con capacidad de promoción del crecimiento vegetal y solubilización de nutrientes de baja disponibilidad, sino también con propiedades de estimulación de resistencia contra estrés biótico, resulta ventajoso identificar microorganismos que no sólo tengan todas estas características sino que también produzcan otras sustancias con efectos beneficiosos tales como aminoácidos, que favorecen el crecimiento de las plantas, o ácidos orgánicos de la familia del salicilato y del jasmónico que inducen resistencia sistémica.

Los 20 aminoácidos proteinogénicos, susceptibles de ser utilizados bien directamente o bien tras su modificación química, se utilizan en una gran variedad de propósitos, por ejemplo, en productos con valor nutricional añadido, potenciadores del sabor, aditivos para alimentación animal, cosméticos, fármacos, pesticidas, fertilizantes, etc.

En los últimos años, la producción de aminoácidos se ha centrado en la industria de la producción de abonos orgánicos, en la que se venden como bioactivadores, en respuesta a las limitaciones de la legislación frente al uso de fertilizantes químicos inorgánicos y sus efectos adversos sobre el medio ambiente.

Hoy en día, la mayoría de los aminoácidos se producen a partir de fermentación bacteriana [Ikeda. Amino acid production processes (2003)

Biotechnology, vol 79, Springer - Verlag. 1:35], sobre todo por bacterias modificadas genéticamente.

Los procesos microbiológicos utilizados para la obtención de aminoácidos se clasifican de la siguiente manera [Kumagai. Microbial production of amino acids in Japan (2000) Biotechnology, vol 69, Springer -Verlag. 71:85]:

a) utilización de cepas silvestres (producción de ácido L-glutámico, L-alanina, L- valina);

b) utilización de mutantes (producción de L-lisina, L -treonina, L -arginina, L - citrulina, L-ornitina, L-homoserina, L-triptófano, L-fenilalanina, L-tirosina, L- histidina, etc.);

c) adición de precursores (producción de L-treonina, L-isoleucina, L-triptófano, etc.);

d) métodos enzimáticos (producción de ácido L-aspártico, L-alanina, L-cisteína, dihidroxi-fenilalanina, etc.); y

e) utilización de cepas generadas mediante ingeniería genética y metabólica, o por combinaciones de las mismas (producción de hidroxi-L-prolina).

El mayor volumen de producción de aminoácidos se centra en la industria alimentaria, concretamente en la producción de potenciadores del sabor, seguida de cerca por la industria de alimentación para animales, experimentando un aumento en la industria de producción de abonos orgánicos, en la que se venden como bioactivadores.

Los bioactivadores vegetales constituyen toda una nueva generación de productos orgánicos, que conforman un giro obligado de la industria ante el endurecimiento de la legislación frente al uso de fertilizantes químicos inorgánicos y sus efectos adversos sobre el medio ambiente, dando lugar a la búsqueda y estudio de nuevas fuentes naturales de abonos, bioestimulantes y enmiendas para el suelo [Crouch et al., Evidence for the presence of plant growth regulators in commercial seaweed products (1993) Plant Growth Regulation 13:21], unido al interés creciente de la sociedad por la agricultura ecológica.

Las plantas son capaces de sintetizar aminoácidos, siendo un proceso complejo de elevado gasto energético que requiere carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrógeno, por lo que el aporte externo de estos compuestos se hace ineludible para mejorar el desarrollo de la planta durante aquellos momentos del ciclo donde es necesario facilitar la producción de otros compuestos más complejos como fitoalexinas y compuestos cianógenos para la defensa frente a ataques de patógenos, vitaminas

para el desarrollo de las plantas, compuestos cromógenos que forman parte de distintos pigmentos dando lugar a colores en flores y frutos, y hormonas vegetales [Singh. Plant amino acids (2006) Amino Acids 30:111],

La incorporación de los aminoácidos en las plantas se produce vía foliar o radicular, siendo éste último el mecanismo más frecuente de aporte de aminoácidos externos. Los aminoácidos contenidos en los abonos orgánicos, provienen en su mayoría de hidrólisis enzimática de restos orgánicos (animales y/o vegetales), o de extractos de algas, que por su parte tienen la ventaja de proporcionar hormonas vegetales tales como citoquininas y auxinas, como compuestos activos [Schmidt et al., Questions and answers about biostimulants (2003) Golf Course Management 91:94],

Otras aproximaciones para obtener productos de origen biológico que produzcan estos efectos beneficiosos sobre el desarrollo vegetal comprenden el uso de bacterias promotoras del crecimiento vegetal o PGPRs (del inglés "Plant Growth Promoting Rhizobacteria"), en las que se utilizan microorganismos vivos que colonizan eficazmente la rizosfera, son capaces de mantenerse en ella y, además, de producir nutrientes para la planta hospedadora, influenciar positivamente de manera indirecta el crecimiento y desarrollo de la raíz y/o estimular el crecimiento de la planta mediante el control de patógenos [Vessey. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers (2003) Plant and Soil 255:571],

Es difícil obtener un microorganismo que cumpla muchos de estos requisitos, por lo que resulta propicio identificar aquéllos que contengan el mayor número de estas características, es decir, que sean eficaces como biofertilizantes, fitoestimulantes y agentes de biocontrol [Bloemberg and Lugtenberg. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria (2001) Current Opinión in Plant Biology 4:343] y, además, produzcan otro tipo de sustancias beneficiosas, no descritas anteriormente en este tipo de microorganismos, como aminoácidos, que, entre otros, tienen efectos beneficiosos sobre la biosíntesis de proteínas, resistencia a estreses abióticos, quelación de micronutrientes, son precursores de fitohormonas (L- triptófano, L-valina), formación de frutos, germinación de semillas (L-fenilalanina), etc.

Por tanto, resultaría interesante disponer de microorganismos capaces de producir compuestos que inducen resistencia sistémica en plantas y compuestos estimuladores del crecimiento de las plantas; ventajosamente, dichos microorganismos deberían producir, además, aminoácidos y/o solubilizar fosfatos insolubles y/o hierro. Dichos microorganismos podrían ser utilizados como biofertilizantes, fitoestimulantes y

agentes inductores de la resistencia sistémica inducida sin los inconvenientes que presentan otras alternativas del estado de la técnica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Se ha aislado y caracterizado una cepa de Pseudomonas fluorescens capaz de producir compuestos estimuladores del crecimiento vegetal y compuestos que inducen una respuesta sistémica en la planta frente a estreses ambientales y/o frente a agentes fitopatógenos, y que, además, solubiliza fosfatos insolubles y hierro presentes en el suelo o en sustratos sólidos, pudiendo utilizar las formas solubilizadas como nutrientes. Ventajosamente, dicho microorganismo tiene la capacidad de sobreproducir un aminoácido, preferentemente, un L-aminoácido, por ejemplo, un aminoácido seleccionado del grupo formado por L-triptófano, L-fenilalanina, L-valina, N- bencilglicina, y cualquier combinación de los mismos

Por tanto, la presente invención contribuye a la disminución del uso de compuestos fitosanitarios (e.g., fungicidas, etc.) debido a la capacidad de dicho microorganismo para producir metabolitos que incrementan la resistencia frente a agentes fitopatógenos presentes en el suelo (que, preferentemente, atacan el sistema radicular de las plantas), a la disminución del uso de fertilizantes... [Seguir leyendo]

1. Un microorganismo de la especie Pseudomonas fíuorescens BIRD-5 depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 7851 que tiene las siguientes características:

a) induce la producción de compuestos que inducen resistencia sistémica en plantas;

b) induce la producción de compuestos estimuladores del crecimiento de las plantas; y

c) solubiliza fosfatos insolubles y hierro;

o un muíante de dicho microorganismo que mantiene dichas características.

2. Microorganismo según la reivindicación 1, que además, sobreproduce al menos un aminoácido.

3. Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2, que sobreproduce un aminoácido seleccionado del grupo formado por L-triptófano, L-fenilalanina, L-valina, N-bencilglicina, y cualquiera de sus combinaciones.

4. Un cultivo biológicamente puro de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un fertilizante suplementado que comprende un fertilizante y un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un soporte sólido activo que comprende un soporte sólido agrícolamente aceptable y un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Una semilla suplementada que comprende una semilla y un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, opcionalmente adherido a un soporte sólido.

8. Un cepellón suplementado que comprende un cepellón y un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, opcionalmente adherido a un soporte sólido.

9. Un caldo de cultivo obtenible mediante un procedimiento que comprende las

etapas:

a) cultivar un microorganismo proporcionado por la presente invención en un medio de cultivo mínimo que comprende una fuente de carbono susceptible de ser utilizada por el microorganismo de la invención,

b) incubar la suspensión bacteriana resultante de la etapa a) a una temperatura comprendida entre 15°C y 40°C hasta alcanzar una densidad celular igual o superior a 109 unidades formadoras de colonia (ufc)/ml_; y

c) separar el caldo de cultivo, y, si se desea,

d) filtrar dicho caldo de cultivo a través de un filtro estéril con un diámetro de poro de 0,22 pm.

10. Un procedimiento para estimular el crecimiento de una planta, que comprende aplicar una cantidad eficaz de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un fertilizante suplementado según la reivindicación 5, un soporte sólido activo según la reivindicación 6, o un caldo de cultivo según la reivindicación 9, a la planta o a la zona de influencia de la raíz, o, alternativamente, sembrar una semilla de dicha planta, suplementada con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

11. Un procedimiento para proteger una planta frente a un agente fitopatógeno, mediante la inducción de resistencia sistémica en la planta frente a dicho agente fitopatógeno, que comprende aplicar una cantidad eficaz de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un fertilizante suplementado según la reivindicación 5, un soporte sólido activo según la reivindicación 6, o un caldo de cultivo según la reivindicación 9, a la planta o a la zona de influencia de la raíz, o, alternativamente, sembrar una semilla de dicha planta, suplementada con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Un procedimiento para controlar biológicamente un agente fitopatógeno, en donde dicho agente fitopatógeno es susceptible de atacar a dicha planta, que

comprende poner en contacto dicha planta con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un fertilizante suplementado según la reivindicación 5, un soporte sólido activo según la reivindicación 6, o un caldo de cultivo según la reivindicación 9, bajo condiciones que permiten la adquisición de inmunidad contra dicho agente fitopatógeno mediante la adquisición de un mecanismo de resistencia sistémica.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en el que dicho agente fitopatógeno es un hongo o bacteria.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11a 13, en el que dicho hongo fitopatógeno es un hongo del género Fusarium, Rhizoctonia,o Phytophtora.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11a 13, en el que dicha bacteria fitopatógena es una bacteria del género Erwinia o Ralstonia.

16. Un procedimiento para restablecer el estado general de la planta tras una situación de estrés ambiental (abiótico), que comprende aplicar una cantidad eficaz de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un fertilizante suplementado según la reivindicación 5, un soporte sólido activo según la reivindicación 6, o un caldo de cultivo según la reivindicación 9, a la planta o a la zona de influencia de la raíz.

17. Un procedimiento para la solubilización microbiológica, en condiciones aeróbicas, de un fosfato insoluble en un sustrato sólido que contiene un fosfato insoluble, que comprende poner en contacto dicho sustrato sólido a tratar con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o con un fertilizante suplementado según la reivindicación 5, o con un soporte sólido activo según la reivindicación 6.

18. Un procedimiento para la solubilización microbiológica, en condiciones aeróbicas, de fosfato insoluble presente en un suelo que contiene un fosfato insoluble, que comprende poner en contacto dicho suelo que contiene un fosfato insoluble a tratar con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

19. Un procedimiento para la solubilización microbiológica, en condiciones aeróbicas, de hierro insoluble en un sustrato sólido que contiene hierro insoluble, que comprende poner en contacto dicho sustrato sólido a tratar con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un fertilizante suplementado según la reivindicación 5, o un soporte sólido activo según la reivindicación 6.

20. Un procedimiento para la solubilización microbiológica, en condiciones aeróbicas, de hierro insoluble presente en un suelo que contiene hierro insoluble, que comprende poner en contacto dicho suelo que contiene hierro insoluble a tratar con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

21. Un procedimiento para la solubilización microbiológica, en condiciones aeróbicas, de un fosfato insoluble y de hierro en un sustrato sólido que contiene un fosfato insoluble y hierro insoluble, que comprende poner en contacto dicho sustrato sólido a tratar con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un fertilizante suplementado según la reivindicación 5, o un soporte sólido activo según la reivindicación 6.

22. Un procedimiento para la solubilización microbiológica, en condiciones aeróbicas, de fosfato insoluble y hierro insoluble presente en un suelo que contiene un fosfato insoluble y hierro insoluble, que comprende poner en contacto dicho suelo que contiene un fosfato insoluble y hierro insoluble a tratar con un microorganismo microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

23. Un procedimiento para la obtención de un mutante de Pseudomonas fluorescens BIRD-5 (CECT 7851) que, además de mantener las características a) - c) de la cepa P. fluorescens BIRD-5 (CECT 7851) parental, sobreproduce al menos un aminoácido.

24. Un procedimiento para la obtención de un mutante de Pseudomonas fluorescens BIRD-5 (CECT 7851) que, además de mantener las características a) - c) de la cepa P. fluorescens BIRD-5 (CECT 7851) parental definidas en la reivindicación 1, sobreproduce al menos un aminoácido, comprendiendo dicho procedimiento los siguientes pasos:

a) seleccionar y proporcionar un microorganismo aislado de una raíz o de un suelo rizosférico sospechoso de contener microorganismos rizosféricos, en donde dicho microorganismo presenta las siguientes seleccionar características:

a) induce la producción de compuestos que inducen resistencia sistémica en plantas;

b) induce la producción de compuestos estimuladores del crecimiento de las plantas; y

c) solubiliza fosfatos insolubles y hierro;

b) inducir una mutación en el microorganismo del paso a) poniendo en contacto dicho microorganismo con un agente mutagénico en un medio de cultivo sólido que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, micronutrientes y un análogo del aminoácido del que se espera que el microorganismo seleccionado en la etapa a) excrete al medio externo;

c) incubar el microorganismo resultante del paso b) en dicho medio de cultivo sólido que comprende dicha fuente de carbono, dicha fuente de nitrógeno, dicha fuente de fósforo, dichos micronutrientes y dicho análogo del aminoácido del que se espera que el microorganismo excrete al medio externo, en condiciones aeróbicas y a una temperatura comprendida entre 28°C y 30°C aproximadamente, permitiendo el crecimiento de la cepa susceptible de mutación;

d) al cabo de un periodo de tiempo de, al menos 24 horas, aislar y purificar las colonias diferenciadas del microorganismo provisto en el paso a) en el área de acción del agente mutágeno introducido en el medio sólido en el paso

b);

e) repicar las colonias obtenidas en el paso d) a un medio sólido que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, micronutrientes y un análogo del aminoácido a la concentración a la que se ha introducido en el medio en el paso b), para comprobar que dichas colonias son capaces de crecer en presencia del análogo;

f) sembrar en placas colonias que, aisladas y purificadas en la etapa e), u, opcionalmente, seleccionadas en la etapa d), son capaces de crecer en presencia del análogo de aminoácido correspondiente añadido en la etapa b);

g) sembrar en estría las colonias procedentes del paso d), o del paso e), en un medio sólido que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo y micronutrientes, y, paralelamente a cada estría de las colonias bioensayo, sembrar en estría a una distancia, no mayor de 5 mm, un microorganismo auxótrofo para el aminoácido susceptible de ser producido por las colonias seleccionadas en el paso d), o en el paso e), con el fin de descartar los mutantes obtenidos en el paso d), o posteriormente purificados en el paso e), que su mecanismo para tolerar la presencia del análogo de aminoácido, que se introdujo en el medio en la etapa b), no comprende la producción de aminoácido;

h) incubar las placas resultantes del paso g) en condiciones aeróbicas a una temperatura comprendida entre 28°C y 30°C aproximadamente;

i) al cabo de un periodo de tiempo de, al menos 24 horas, observar si se produce crecimiento de los microorganismos auxótrofos, sembrados en estría paralelamente a los mutantes seleccionados en la etapa g);

j) observar la aparición de crecimiento microbiano en las estrías de los microorganismos auxótrofos, sembrados en la etapa g), en donde la aparición de dicho crecimiento microbiano en dichas estrías de los microorganismos auxótrofos, sembrados en la etapa g), es indicativa de la producción de aminoácido por los mutantes seleccionados en el paso d);

k) someter las colonias de los mutantes obtenidos en el paso d), o en el paso f), que se consideren positivas tras el paso j), a otra prueba para descartar mutantes menos efectivos en la posible producción de aminoácidos;

l) cultivar los mutantes seleccionados en el paso k) en un medio líquido que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo y micronutrientes, en condiciones aeróbicas,, a una temperatura comprendida entre 28°C y 30°C aproximadamente, durante, al menos, 24 horas;

m) sembrar unas gotas de cada mutante en un medio sólido que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo y micronutrientes, y, a una distancia mínima, entre ellas y la gota del mutante a ensayar de 5 mm, sembrar unas gotas del auxótrofo para el aminoácido susceptible de ser producido por las colonias seleccionadas en el paso k);

n) incubar las placas del paso m) bajo condiciones aeróbicas a una temperatura comprendida entre 28°C y 30°C aproximadamente durante, al

menos, 24 horas y hasta una semana, y, finalizada la incubación, una vez que los mutantes a testar han crecido, comprobar si se ha producido crecimiento en las gotas de auxótrofos y la distancia hasta el mutante a testar hasta donde se ha producido el crecimiento;

o) seleccionar de entre los mutantes positivos del paso n) aquellos que hayan permitido crecimiento de los auxótrofos a mayor distancia de la gota del mutante a ensayar;

p) someter los mutantes seleccionados en el paso o) a un ensayo de nutrición cruzada, en el que se incuban durante 24 h aproximadamente, en condiciones aeróbicas, las cepas a ensayar en un medio mínimo líquido que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y una fuente de fósforo a una temperatura comprendida entre 28°C y 30°C aproximadamente; una vez transcurrido ese periodo de tiempo, esterilizar los cultivos mediante filtración por paso a través de un filtro de 0,22 pm de diámetro de poro; inocular un microorganismo auxótrofo para el aminoácido susceptible de ser producido por las cepas mutantes; incubar los cultivos resultantes en condiciones aeróbicas a una temperatura comprendida entre 28°C y 30°C aproximadamente, durante al menos 72 horas, observando cada 24 horas la turbidez del cultivo; transcurrido ese periodo de tiempo, observar si se produce crecimiento; y seleccionar aquellos mutantes que produzcan crecimiento en las cepas auxótrofas porque son considerados positivos para la producción de aminoácidos;

q) someter los mutantes seleccionados en el paso p) a pruebas para comprobar si mantienen las características a)-c) de P. fíuorescens BIRD-5 (CECT 7851); y, si se desea,

r) una vez realizadas dichas pruebas para comprobar el mantenimiento de las características a)-c) de P. fíuorescens parental provista en la etapa a), calcular la cantidad de aminoácido excretado por el mutante resultante de la selección llevada a cabo en las etapas o) y p).

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

N.° solicitud:

Fecha de presentación de la solicitud: 23.10.2013 Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

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C12R1/39 (2006.01)

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