Métodos para reducir el nivel de una o más impurezas en una muestra durante la purificación de proteínas.

Un método para reducir el nivel de una o más impurezas asociadas con una proteína de interés en una muestra,

comprendiendo el método las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra que comprende una proteína de interés y una o más impurezas con una o más columnas de cromatografía que contienen medios de afinidad, medios AEX, medios CEX, medios HIC o medios de modo mixto, en condiciones tales que la proteína de interés se une al medio en la una o más columnas de cromatografía;

(ii) obtener un eluato de la muestra que comprende la proteína de interés;

(iii) poner en contacto el eluato de (ii) en modo de flujo pasante con uno de:

(a) un material carbonoso; y

(b) una combinación de un material carbonoso y uno o más de medios de afinidad, medios CEX, medios AEX, medios de modo mixto y medios HIC; y

(iv) obtener la muestra de flujo pasante de (iii) que comprende la proteína de interés en donde la muestra en (iv) comprende un nivel menor de una o más impurezas con relación al nivel de una o más impurezas en el eluato en (ii).

Métodos para reducir el nivel de una o más impurezas en una muestra durante la purificación de proteínas Aplicaciones relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional N° 61/575.349, con fecha de presentación de 19 de Agosto de 2011, y la solicitud de patente provisional N° 61/666.240, con fecha de presentación 29 de Junio de 2012.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de cromatografía mejorados y métodos para reducir el nivel de una o más impurezas durante la purificación de proteínas.

Antecedentes

La cromatografía es una técnica de purificación dominante en la purificación de materiales biológicos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales.

Los métodos de cromatografía usados comúnmente incluyen uno o más de medios de cromatografía de afinidad, medios de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, de interacción hidrofílica, de modo mixto y de exclusión de tamaños (es decir, combinación de diversas interacciones de cromatografía). Por ejemplo, para la purificación de anticuerpos monoclonales, un proceso de purificación típico incluye una etapa de captura de afinidad de Proteína A inicial seguida de una o más etapas de pulido de intercambio, cuyo propósito es reducir el nivel de una o más impurezas tales como, por ejemplo, proteína celular huésped (HCP). Además, se pueden usar otras técnicas cromatográficas, tales como: cromatografía de interacción hidrofóbica de unir y eluir (HIC); cromatografía de interacción hidrofóbica de flujo pasante (FTHIC); cromatografía de intercambio aniónico de flujo pasante (AEX); cromatografía de partición débil con intercambio catiónico, intercambio aniónico o resinas de interacción hidrofóbica; técnicas de cromatografía de modo mixto, por ejemplo, intercambio aniónico y catiónico débil de unir y eluir, interacción de intercambio iónico e hidrofóbico de unir y eluir e interacción de modo mixto de intercambio iónico e hidrofóbico de flujo pasante (FTMM), las cuales pueden utilizar resinas tales como Capto Adhere, Capto MMC, HEA Hypercel, PPA Hypercel. Adicionalmente, para el pulido se puede usar la cromatografía de inducción de carga hidrofóbica (HCI) junto con otras y combinaciones de diversas técnicas.

Aunque la cromatografía ofrece muchas ventajas para la purificación de proteínas a una escala menor, a una escala mayor, el relleno de columnas de cromatografía es trabajoso y requiere tiempo, además de caro. Además, el ensuciamiento de las columnas de cromatografía es un problema común, dando como resultado que el usuario tiene que desechar columnas, lo que es indeseable, especialmente debido al elevado coste de las resinas de cromatografía.

Recientemente, ha habido una tendencia notable en la industria para tratar de reducir el número de etapas en los procesos de purificación de proteínas. También, es una tendencia creciente en la industria el uso de técnicas para la obtención de un título de expresión más alto usando biorreactores. La combinación de estas dos tendencias ha dado lugar a que se carga en una columna más producto, lo que da como resultado una carga aumentada de medios de cromatografía bastante caros asi como una menor pureza del producto, ambos de los cuales son indeseables.

Compendio de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento sorprendente e inesperado de que ciertos materiales (por ejemplo, material carbonoso tal como carbón activado) se pueden incorporar en los procesos de purificación de proteínas basadas en columna de cromatografía en un modo de flujo pasante, lo que resulta en la reducción de la carga de las columnas de cromatografía, y por consiguiente el aumento de la vida útil de las columnas de cromatografía.

Además, la presente invención se basa en el descubrimiento e inesperado de que los materiales carbonosos (por ejemplo, carbón activado) se pueden usar bien corriente arriba o corriente abajo de una etapa de cromatografía de captura para reducir el nivel de una o más impurezas. En algunas realizaciones según los métodos reivindicados, se pone en contacto una muestra con un material carbonoso antes de una etapa de cromatografía de intercambio catiónico (CEX). En otras realizaciones, se usa una etapa de cromatografía de intercambio catiónico (CEX) antes de poner en contacto una muestra con un material carbonoso. En aún otras realizaciones, se pone en contacto una muestra con un material carbonoso después de la etapa de captura de afinidad de Proteína A. Alternativamente, la etapa de cromatografía de afinidad de Protema A se puede usar después de poner en contacto la muestra con un material carbonoso. En algunas realizaciones, la etapa de captura de afinidad de Proteína A puede estar seguida de una etapa de cromatografía de flujo pasante de intercambio aniónico (AEX) y con o sin una etapa de unión/elución de cromatografía CEX. Aún en otras realizaciones, el material carbonoso se puede usar después de una etapa de captura de no afinidad (por ejemplo, usando cromatografía de unir y eluir CEX como una etapa de captura) y está seguido de una etapa de cromatografía AEX.

Además, la presente invención proporciona procesos de purificación de proteínas basados en cromatografía que incluyen menos etapas que los procesos convencionales.

En un aspecto según la presente Invención, se proporciona un método para reducir la carga de una o más columnas cromatográficas. En algunas realizaciones, tal método comprende poner en contacto una muestra que comprende una proteína de Interés y una o más Impurezas en un modo de flujo pasante con uno de: (i) un material carbonoso; (¡i) una combinación de un material carbonoso y medios CEX; (iii) una combinación de un material carbonoso y medios AEX; (¡v) una combinación de un material carbonoso y medios de modo mixto; (v) una combinación de un material carbonoso y medios HIC, y (vi) una combinación de un material carbonoso y medios CEX, AEX y de modo mixto, antes de poner en contacto la muestra con uno o más columnas cromatográficas que contienen medios de afinidad, medios AEX, medios CEX, medios HIC o medios en modo-mixto, para reducir de ese modo la carga de una o más columnas cromatográficas.

En otro aspecto según los métodos reivindicados, se proporciona un método para reducir el nivel de una o más impurezas en una muestra que contiene una proteína de interés y la una o más impurezas de interés, en donde el método comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra que comprende una proteína de interés y una o más impurezas con una o más columnas de cromatografía que contienen medios de afinidad, medios AEX, medios CEX, medios HIC o medios de modo mixto, en condiciones tales que la proteína de interés se une a la columna; (¡i) obtener un primer eluato de la muestra; (iii) poner en contacto el primer eluato en modo de flujo pasante con uno de: (a) un material carbonoso; y (b) una combinación de un material carbonoso y uno o más de medios CEX, medios AEX, medios de modo mixto y medios HIC; y (iv) obtener un segundo eluato de la muestra; donde el segundo eluato comprende un nivel menor o reducido de una o más impurezas con relación al nivel de una o más impurezas en el primer eluato.

Aún en otro aspecto, se proporciona un método para reducir el nivel de una o más impurezas en una muestra que comprende una proteína de interés y una o más impurezas, comprendiendo el método las etapas de: (i) poner en contacto una muestra que comprende una proteína de interés y una o más impurezas con una columna de cromatografía que contiene medios de afinidad; (ii) obtener un primer eluato de la muestra; (iii) poner en contacto el primer eluato en modo de flujo pasante con un material carbonoso; (iv) obtener un segundo eluato de la muestra; (v) poner en contacto el segundo eluato con medios de cromatografía de intercambio aniónico; y (vi) obtener un tercer eluato de la muestra, en donde el tercer eluato comprende un nivel menor o reducido de una o más impurezas con relación al nivel de una o más impurezas cuando el primer eluato con está en contacto con el material carbonoso.

En algunas realizaciones, tal método incluye una etapa de cromatografía de unir y eluir CEX después de la etapa de captura de afinidad y antes de poner en contacto la muestra con medios cromatográficos de intercambio aniónico, lo que el algunas realizaciones es un adsorbente de membrana. En algunas realizaciones, un método según la invención reivindicada obvia la necesidad de etapas cromatográficas adicionales, por ejemplo, una etapa de cromatografía de unir y eluir CEX usada después de la etapa... [Seguir leyendo]

1.- Un método para reducir el nivel de una o más impurezas asociadas con una proteína de interés en una muestra, comprendiendo el método las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra que comprende una proteína de interés y una o más impurezas con una o más columnas de cromatografía que contienen medios de afinidad, medios AEX, medios CEX, medios HIC o medios de modo mixto, en condiciones tales que la proteína de interés se une al medio en la una o más columnas de cromatografía;

(¡I) obtener un eluato de la muestra que comprende la proteína de interés;

(ni) poner en contacto el eluato de (¡i) en modo de flujo pasante con uno de:

(a) un material carbonoso; y

(b) una combinación de un material carbonoso y uno o más de medios de afinidad, medios CEX, medios AEX, medios de modo mixto y medios HIC; y

(¡v) obtener la muestra de flujo pasante de (i¡¡) que comprende la proteína de interés en donde la muestra en (iv) comprende un nivel menor de una o más impurezas con relación al nivel de una o más impurezas en el eluato en (ii).

2.- El método de las reivindicación 1, en donde el medio de afinidad se selecciona de Proteína A o Proteína G.

3.- El método de la reivindicación 1, en donde el material carbonoso es carbón activado.

4.- El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de flujo pasante de (iii) se pone en contacto con un medio

de Intercambio amónico en un modo de flujo pasante.

5.- El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de flujo pasante de (iii)se pone en contacto con un medio de Intercambio aniónico seguido de un medio de intercambio catiónico en un modo de flujo pasante.

6.- El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (i) emplea medio de afinidad.

7.- El método de la reivindicación 6, en donde el medio de afinidad se selecciona de Proteína A o Proteína G.

8 - El método de la reivindicación 1, en donde la proteína de Interés es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

9.- El método de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

10.- El método de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

11- El método de la reivindicación 1, en donde el método se realiza en un modo continuo.

12. El método de la reivindicación 3, en donde el carbón activado se rellena en una columna, un dispositivo desechable sellado, un cartucho o una cápsula.

13. El método de la reivindicación 3, en donde el carbón activado se impregna en un material poroso.

14. El método de la reivindicación 13, en donde el material poroso está contenido dentro de una columna, un dispositivo desechable sellado, un cartucho o una cápsula.

15. El método de la reivindicación 4, en donde el medio de intercambio aniónico es un medio de sorción poroso que tiene un revestimiento de superficie que comprende una o más aminas primarias poliméricas o copolímeros de las mismas.

16. El método de la reivindicación 4, en donde el medio de intercambio aniónico es un medio de adsorción poroso que tiene un revestimiento de superficie que comprende una o más aminas primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias.

17.- El método de la reivindicación 4, en donde el medio de intercambio aniónico es un medio de adsorción poroso que tiene un revestimiento de superficie que comprende una o más aminas primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias.

18.- El método de la reivindicación 3, en donde carbón activado comprende carbón vegetal activado.