Método para la valoración de riesgo cardiovascular no clásico mediante la detección de autoanticuerpos anti-lipoproteínas de alta densidad, inmunosensor y kit para su aplicación.

Método para la valoración de riesgo cardiovascular no clásico mediante la detección de autoanticuerpos anti-lipoproteínas de alta densidad,

inmunosensor y kit para su aplicación. El método comprende poner en contacto una muestra del sujeto con partículas de HDL humanas en condiciones tales que pueda producirse una unión específica antígeno-anticuerpo detectable, y estratificar el riesgo cardiovascular del sujeto comparando el resultado obtenido en el análisis de la muestra con los obtenidos en la población sana.

La invención resulta de aplicación en los sectores de la biotecnología y la farmacia y en el de la medicina y el diagnóstico clínico, y más concretamente en la valoración de riesgo cardiovascular para prevenir enfermedades mediante el uso de biomarcadores en diferentes grupos de pacientes.

METODO PARA LA VALORACIÓN DE RIESGO CARDIOV ASCULAR NO CLÁSICO MEDIANTE LA DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS ANTI LIPOPROTEÍNAS DE ALTA DENSIDAD, INMUNOSENSOR y KIT PARA SU APLICACIÓN

La presente invención se refiere a un método para la valoración de riesgo cardiovascular y a un kit para realizar dicha valoración. En particular, se refiere a un método de determinación de riesgo cardiovascular no asociado a los factores clásicos mediante la cuantificación de los niveles de auto anticuerpos frente a las lipoproteínas de alta densidad (HDL) . La invención incluye también un inmunosensor y un kit para la cuantificación de los anti-HDL en muestras de sangre, suero o plasma. La presencia de estos auto anticuerpo s se asocia a una alteración de las HDL y a un aumento en diferentes mediadores implicados en respuestas inflamatorias proaterogénicas que no pueden ser detectados por los métodos disponibles actualmente para valorar el riesgo cardiovascular pero que son de relevancia para su correcta valoración.

La invención resulta de aplicación en los sectores de la biotecnología y la farmacia y en el de la medicina y el diagnóstico clínico, y más concretamente en la valoración de riesgo cardiovascular para prevenir enfermedades mediante el uso de biomarcadores en diferentes grupos de pacientes.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Enfermedad cardiovascular y aterosclerosis.

La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte en países occidentales y se estima que pueda llegar a ser la principal causa de muerte a nivel global en las próximas décadas. Asimismo, en términos comunitarios, la enfermedad cardiovascular implica elevados costes para los sistemas nacionales de salud y es causa de importantes pérdidas económicas y baja productividad laboral. Las principales presentaciones clínicas de la enfermedad cardiovascular son la enfermedad isquémica (infarto de miocardio y angina de pecho) , accidentes cerebrovasculares (ictus isquémico, no isquémico y ataques isquémicos transitorios) y enfermedad arterial periférica.

En líneas generales, la enfermedad cardiovascular tiene su ongen en el desarrollo de placas ateroscleróticas en la pared de los vasos sanguíneos, que conlleva un aumento de espesor de la capa más interna del vaso (o capa íntima) , el cual condiciona la correcta circulación del flujo sanguíneo a su través. El crecimiento de la placa aterosclerótica puede llegar a obstruir completamente el vaso sanguíneo, o bien ésta puede transformarse en una placa inestable, susceptible de separarse de la pared del vaso en que se origina y provocar así la oclusión de un vaso de menor calibre (enfermedad tromboembólica) . La formación de la placa aterosclerótica es un proceso dinámico, dependiendo su progresión de los factores de riesgo asociados y el período de exposición a los mismos y de la carga genética.

Estratificación del riesgo cardiovascular.

Habida cuenta de la importancia de la enfermedad cardiovascular en términos demográficos y económicos, resulta imprescindible contar con herramientas que permitan una valoración del riesgo cardiovascular, esto es, una valoración de la probabilidad que tiene un individuo de padecer un evento cardiovascular en un periodo de tiempo dado, normalmente fijado por consenso en 10 años. El objetivo último de los algoritmos de estratificación de riesgo cardiovascular es la toma de decisiones en el ámbito clínico, de forma que los pacientes puedan ser sometidos a intervenciones de prevención primaria y secundaria con el objetivo de reducir su riesgo cardiovascular.

En los últimos años, se han producido avances en el campo de la prevención de la enfermedad cardiovascular, si bien, paradójicamente, la incidencia de ésta continúa en aumento. El mejor conocimiento del papel de los factores de riesgo y su interrelación ha llevado a un cambio en el paradigma del estudio del riesgo cardiovascular, pasando los factores de riesgo de ser estudiados de forma individual a ser considerados de forma conjunta bajo el concepto de "riesgo global", el cual proporciona una fuerza predictiva de mayor valor que cualquier factor de forma independiente (Grundy, et al. (1998) "Primar y prevention of coronar y heart disease: guidance from Framingham: a statement for healthcare professionals from the AHA Task Force on Risk Reduction". American Heart Association. Circulatian, 97, 18761887; Jackson, (2000) "Guidelines on preventing cardiovascular disease in clinical practice." BMJ, 320, 659-661; Pearson, et al. (2003) "Markers of inflammation and cardiovascular disease: application to clinical and public health practice: A statement for healthcare professionals from the Centers for Disease Control and Prevention and the American Heart Association." Circulatian, 107, 499-511; Pyorala, et al. (1994) "Prevention of coronar y heart disease in clinical practice. Recommendations of the Task Force of the European Society of Cardiology, European Atherosclerosis Society and European Society ofHypertension." Eur.Heart J, 15, 1300-1331) .

Los algoritmos actuales para la valoración del riesgo cardiovascular global se basan en la presencia y grado de diferentes factores clásicos de riesgo cardiovascular, como son la edad, el género, la hipertensión, las dislipemias, la diabetes, la obesidad y el hábito tabáquico. Sin embargo, la valoración cuantitativa y cualitativa de cada uno de estos factores de riesgo varía dependiendo de la escala utilizada. El más conocido de estos algoritmos es la escala de Framingham (Framingham Risk Scare) y su sistema de puntuación se deriva de ecuaciones extraídas a partir de un estudio prospectivo a 10 Y 30 años en población norteamericana (Wilson, et al. (1998) "Prediction of coronar y heart disease using risk factor categories." Circulatian, 97, 1837-1847; Dawber, et al. (1962) "The epidemiology of coronar y heart disease--the Framingham enquir y ." Proc.R.Sac.Med., 55, 265-271) . No obstante, esta escala parece no proporcionar resultados adecuados en población europea y otras poblaciones no norteamericanas, precisamente por estar inferida de una población distinta. Por este motivo, se desarrolló de forma paralela un sistema de valoración ajustado para población europea, denominado escala SCORE (Systematic Caronar y Risk Evaluatian) (Cornoy, et al. (2003) "Estimation of ten-year risk of fatal cardiovascular disease in Europe: the SCORE project." Eur.Heart J, 24, 987-1003) . Del mismo modo, si bien este sistema está calibrado para la población europea, parece sobreestimar el riesgo cardiovascular global en poblaciones mediterráneas, caracterizadas por una mayor prevalencia de factores de riesgo junto con una menor incidencia de enfermedad cardiovascular. Estas observaciones condujeron al desarrollo de otra escala de valoración, derivada de una modificación de la escala de Framingham y calibrada para la población española, denominada REGICOR (Registre Geroní del Cor) (Ramos, et al. (2003) "Comparison of population coronar y heart disease risk estimated by the Framingham original and REGICOR calibrated functions." Med.Clin. (Barc.) , 121, 521-526) .

La correspondencia entre las diferentes escalas ha sido y es actualmente motivo de debate. Además de las diferencias debidas a las diferentes poblaciones estudiadas (D'Agostino, et al. (2001) "Validation of the Framingham coronar y heart disease prediction scores: results of a multiple ethnic groups investigation." JAMA, 286, 180-187; Hense, et al. (2003) "Framingham risk function overestimates risk of coronar y heart disease in men and women from Germany--results from the MONICA Augsburg and the PROCAM cohorts." Eur.Heart J, 24, 937-945; Pyorala, (2000) "Assessment of coronar y heart disease risk in populations with different levels of risk." Eur.Heart J, 21, 348-350) , existen importantes diferencias en cuanto a la variable estudiada (Conroy, et al. (2003) "Estimation of ten-year risk of fatal cardiovascular disease in Europe: the SCORE project." Eur.Heart J, 24, 987-1003) , en tanto que la escala de Framingham evalúa riesgo de desarrollo de enfermedad cardiovascular no fatal, ciñéndose únicamente a la enfermedad coronaria; mientras que la escala SCORE se basa en mortalidad cardiovascular debida a enfermedad cardiovascular general (Conroy, et al. (2003) "Estimation of ten-year risk of fatal cardiovascular disease in Europe: the SCORE project." Eur.Heart J, 24, 987-1003; Wilson, et al. (1998) "Prediction of coronar y heart disease using risk factor categories." Circulation, 97, 1837-1847) . Por otro lado, el número total de factores de riesgo tenidos en cuenta, así como su valoración relativa para el cálculo del riesgo global, es diferente en cada una de las escalas. Otra limitación de estos algoritmos, presumiblemente derivada de lo anterior, es que los puntos de corte... [Seguir leyendo]

1. Método para la valoración el riesgo cardiovascular no clásico mediante la detección de autoanticuerpos que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto una muestra de sangre, suero o plasma del sujeto con partículas de HDL humanas en condiciones tales que pueda producirse una unión específica antígeno-anticuerpo detectable por cualquier método;

b) estratificar el riesgo cardiovascular del sujeto comparando el resultado obtenido en el análisis de la muestra anterior con los obtenidos en la población sana.

2. Método según la reivindicación 1 donde las partículas de HDL de la etapa a) son purificadas de muestras humanas.

3. Método según la reivindicación 1 donde las partículas de HDL de la etapa a) se obtienen por procedimientos sintéticos.

4. Método según la reivindicación 1 donde las partículas de HDL de la etapa a) están unidas a un soporte sólido que permite la retención de los inmunocomplejos HDLlanti-HDL.

5. Método según la reivindicación 4 donde el soporte sólido es una placa para inmunoensayo de tipo ELISA.

6. Método según la reivindicación 1 donde la detección de la unión específica antígeno-anticuerpo de la etapa a) se realiza utilizando anticuerpos antiinmunoglobulinas humanas unidos a un marcador cualquiera que permita su revelado a partir de un agente específico para dicho marcador.

7. Método según la reivindicación 6 donde el marcador unido a los anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas es un enzima y el agente específico es un sustrato.

8. Método según la reivindicación 6 donde los anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas tienen reactividad específica frente a la inmunoglobulina G (lgG) humana.

9. Método según la reivindicación 1 ó 6 que además comprende la cuantificación absoluta de anticuerpos anti-HDL mediante la utilización de una curva de calibración.

10. Método según la reivindicación 8 ó 9 que además comprende la corrección de los niveles de autoanticuerpos anti-HDL con los niveles de IgG total en la misma muestra.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que además comprende la clasificación del sujeto según su riesgo cardiovascular no clásico mediante la comparación del resultado obtenido con los valores de referencia de la misma población obtenidos siguiendo el mismo procedimiento.

12. Inmunosensor para la valoración del riesgo cardiovascular no clásico mediante la detección de autoanticuerpos anti-HDL que comprende:

a) moléculas de HDL humanas inmovilizadas en una fase sólida acoplada a un sensor que detecta un cambio fisico y/o químico tras la unión específica de los anticuerpos anti-HDL de una muestra de sangre, suero o plasma de un sujeto;

b) unos medios de conversión que convierten la detección anterior en una señal eléctrica cuantificable y procesable por unos medios de procesamiento de señales.

13. Inmunosensor según la reivindicación 12 caracterizado por que la señal eléctrica es proporcional a la cantidad de anticuerpos anti-HDL de la muestra.

14. Un kit para llevar a cabo los métodos definidos en cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende partículas de HDL humanas inmovilizadas en un soporte sólido en condiciones tales que pueda producirse una unión específica antígeno-anticuerpo detectable.

15. Kit según la reivindicación 14 donde el soporte sólido es una placa para inmunoensayo de tipo ELISA.

16. El kit según la reivindicación 14 donde los anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas tienen reactividad específica frente a la inmunoglobulina G (IgG) humana.

17. El kit según la reivindicación 14 caracterizado por que además comprende un reactivo estándar para confeccionar una curva de calibración que permita la cuantificación absoluta de los autoanticuerpos anti-HDL dentro del rango de linealidad del inmunoensayo.