Método para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas, y medio para la diferenciación de las mismas.

Un método para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas,

que comprende cultivar células progenitoras neurales humanas en un medio que comprende ácido fusárico.

Método para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas, y medio para la diferenciación de las mismas

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas, que comprende cultivar células progenitoras neurales humanas en un medio que comprende ácido fusárico. Además, la presente invención se refiere a un medio para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas.

Técnica antecedente

La enfermedad de Parkinson se caracteriza por la degeneración selectiva de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del mesencéfalo. Se están estudiando de forma variada terapias que usan reemplazo de neuronas dopaminérgicas en pacientes con enfermedad de Parkinson a través del trasplante de tejido mesencefálico fetal (véase la Referencia 1). Los injertos de tejido mesencefálico fetal pueden sobrevivir durante un largo periodo en el cerebro humano, restaurar la inervación dopaminérgica al estriado en pacientes y reducir los síntomas motores con enfermedad de Parkinson (véase la Referencia 2).

Aunque el trasplante es un tratamiento prometedor para enfermedad de Parkinson, su aplicación clínica se ha limitado a unos pocos casos, porque es muy difícil obtener grandes cantidades de tejidos fetales abortivos humanos. Para superar este problema, se han investigado diversas células candidatas como posibles células donantes para terapia de trasplante para enfermedad de Parkinson (véase la Referencia 3).

Mientras tanto, parece que las células progenitoras neurales humanas (hNPC) derivadas de tejido mesencefálico fetal son una buena fuente celular candidata para trasplante a causa de su capacidad de auto-renovación para actividad de proliferación a largo plazo y de diferenciación en neuronas dopaminérgicas (véanse las Referencias 4 y 5). Por lo tanto, para tratar la enfermedad de Parkinson a través del reemplazo de neuronas dopaminérgicas (es decir, trasplante), es muy importante establecer un método eficaz para la proliferación y expansión de hNPC y un método eficaz para la diferenciación de hNPC en neuronas dopaminérgicas.

Los métodos para la diferenciación de hNPC en neuronas dopaminérgicas conocidos en las técnicas previas incluyen un método de diferenciación en un medio que contiene ácido ascórbico y dibutiril cíclico adenosina monofosfato (db-AMPc) durante 3 días (véase la Referencia 6); un método de diferenciación en un medio que contiene BDNF (factor neurotrófico derivado de cerebro), dopamina, y forskolina durante 3 semanas (véase la Referencia 7); y un método de diferenciación en un medio que contiene SHH (sonic hedgehog), FGF-8 (factor-8 de crecimiento de fibroblastos), DBNF (factor neurotrófico derivado de cerebro), y ácido ascórbico durante 3 semanas (véase la Referencia 8).

Sin embargo, los métodos de diferenciación de acuerdo con las técnicas previas no muestran potencial satisfactorio de diferenciación; y requieren mucho tiempo para diferenciación. Y además, se incurre en problemas económicos a partir del uso de un medio que contiene excipientes caros, tales como SHH, FGF-8, etc. La tecnología para la proliferación de una gran cantidad de células necesaria para tratar a los pacientes que padecen enfermedad de Parkinson aún es insuficiente. Por lo tanto, aún siguen existiendo muchas limitaciones en las aplicaciones clínicas de los mismos.

Descripción

Problema técnico

La presente invención proporciona un método para diferenciar células progenitoras neurales humanas (hNPC) en neuronas dopaminérgicas, en alto potencial de diferenciación; y un medio útil para la diferenciación. Especialmente, la presente invención proporciona un método para diferenciar hNPC en neuronas dopaminérgicas usando ácido fusárico como agente inductor de diferenciación; y un medio útil para la diferenciación.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas y un medio que comprende un nuevo agente inductor de diferenciación.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un medio de diferenciación útil para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas.

Solución técnica

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas, que comprende cultivar células progenitoras neurales humanas en un medio que comprende ácido fusárico.

En el método de la presente invención, el medio puede prepararse añadiendo ácido fusárico a un medio para diferenciación dopaminérgica que comprende dibutiril cíclico adenosina monofosfato (db-AMPc), forskolina, B27, sonic hedgehog (SHH), y factor-8 de crecimiento de fibroblastos (FGF8).

Como alternativa, en el método de la presente invención, el medio puede ser un medio NB que comprende ácido fusárico, db-AMPc, forskolina, y B27, preferiblemente un medio NB que comprende de 5 pM a 4 mM de ácido fusárico, de 5 pM a 4 mM de db-AMPc, de 5 pM a 2 pM de forskolina, y del ,5 % p/p al 5 % p/p de B27. Más preferiblemente, el medio puede ser un medio NB que comprende 1 pM de ácido fusárico, 1 pM de db-AMPc, 1 pM de forskolina, y el 2 % p/p de B27.

En el método de la presente invención, el cultivo puede realizarse en condiciones de hipoxia que tiene del 2 % al 1 % de presión parcial de oxígeno.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un medio para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas, cuyo medio es un medio NB que comprende ácido fusárico, db-AMPc, forskolina, y B27.

El medio puede ser un medio NB que comprende de 5 pM a 4 mM de ácido fusárico, de 5 pM a 4 mM de db- AMPc, de 5 pM a 2 pM de forskolina, y del ,5 % p/p al 5 % p/p de B27, preferiblemente un medio NB que comprende 1 pM de ácido fusárico, 1 pM de db-AMPc, 1 pM de forskolina, y el 2 % p/p de B27.

Efectos ventajosos

Se descubre mediante la presente invención que, cuando se cultivan células progenitoras neurales humanas en presencia de ácido fusárico, la diferenciación en neuronas dopaminérgicas está remarcadamente aumentada. Especialmente, el método de diferenciación de la presente invención es rentable, porque las células progenitoras neurales humanas pueden diferenciarse en neuronas dopaminérgicas usando ácido fusárico barato, en lugar de los agentes inductores de diferenciación caros; SHH y FGF8, que son de uso limitado. Y además, el método de diferenciación de la presente invención puede mejorar de forma remarcable el potencial de diferenciación insatisfactorio de acuerdo con los métodos de la técnica previa. Por lo tanto, el método de diferenciación de la presente invención puede aplicarse a la fabricación de neuronas dopaminérgicas para tratar daños neuronales incluyendo enfermedad de Parkinson.

Descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra los resultados obtenidos por recuento de TH y Tuj1 a través de tinción DAPI, después de inducción de la diferenciación en neuronas dopaminérgicas usando diversos medios.

La FIG. 2 muestra los resultados obtenidos midiendo los niveles de expresión de TH y Tuj1, después de proliferación de hNPC, seguido por inducción de la diferenciación en neuronas en medios con o sin ácido fusárico 1 pM.

La FIG. 3 muestra los resultados obtenidos realizando inmunocitoquímica y análisis de RT-PCR, después de proliferación de hNPC, seguido por inducción de la diferenciación en neuronas en medios con o sin ácido fusárico 1 pM.

La FIG. 4 muestra los resultados obtenidos midiendo los niveles de expresión de TH en las células, después de inducción de la diferenciación en células dopaminérgicas usando medios con diferentes agentes inductores de la diferenciación.

La FIG. 5 muestra los resultados obtenidos midiendo los potenciales de diferenciación en hipoxia y en normoxia, respectivamente.

La FIG. 6 muestra los resultados obtenidos midiendo los efectos de ácido fusárico, cuando se indujo diferenciación en presencia de MPP.

La FIG. 7 muestra los resultados obtenidos midiendo los niveles de expresión de TH y Tuj1, después de proliferación y subcultivo de hNPC, seguido por inducción de la diferenciación de las hNPC en pase prematuro (pase 7), pase intermedio (pase 11), y pase tardío (pase 17).

La FIG. 8 muestra... [Seguir leyendo]

1. Un método para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas, que comprende cultivar células progenitoras neurales humanas en un medio que comprende ácido fusárico.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio se prepara añadiendo ácido fusárico a un medio para la diferenciación dopaminérgica que comprende dibutiril cíclico adenosina monofosfato (db-AMPc), forskolina, B27, sonic hedgehog (SHH) y factor de crecimiento de fibroblastos 8 (FGF8).

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medio es un medio NB que comprende ácido fusárico, db-AMPc, forskolina y B27.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el medio es un medio NB que comprende de 5 pM a 4 mM de ácido fusárico, de 5 pM a 4 mM de db-AMPc, de 5 pM a 2 pM de forskolina y del ,5 % p/p al 5 % p/p de B27.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el medio es un medio NB que comprende 1 pM de ácido fusárico, 1 pM de db-AMPc, 1 pM de forskolina y 2 % p/p de B27.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cultivo se realiza en condiciones de hipoxia que tienen del 2 % al 1 % de presión parcial de oxígeno.

7. Un medio para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas dopaminérgicas, cuyo medio es un medio NB que comprende ácido fusárico, db-AMPc, forskolina y B27.

8. El medio de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el medio es un medio NB que comprende de 5 pM a 4 mM de ácido fusárico, de 5 pM a 4 mM de db-AMPc, de 5 pM a 2 pM de forskolina y del ,5 % p/p al 5 % p/p de B27.

9. El medio de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el medio es un medio NB que comprende 1 pM de ácido fusárico, 1 pM de db-AMPc, 1 pM de forskolina y 2 % p/p de B27.