Método de reconstrucción holográfico basado en microscopía sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda y programa de ordenador.

Método de reconstrucción holográfico basado en microscopia sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda,

microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda y programa de ordenador

El método comprende:

- iluminar, de manera simultánea, un objeto (O) con luz divergente que incluye tres o más longitudes de onda (λ1 + (λ2 + (λ3+...);

- registrar un holograma múltiple del objeto iluminado (O); y

- obtener, por reconstrucción digital, una imagen holográfica compuesta mediante un procesado digital de la información multiespectral incluida en el holograma múltiple relativa a las tres o más longitudes de onda (λ1 + (λ2 + (λ3+...), que incluye realizar una mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros correspondientes a cada longitud de onda.

El microscopio está adaptado para implementar el método del primer aspecto.

El programa de ordenador implementa la reconstrucción digital del método de la invención.

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conjugadas una con respecto a la otra, y se conocen con el nombre de imagen real y virtual o imágenes gemelas de la holografía.

La existencia de dos imágenes gemelas supone, principalmente, un problema asociado al ruido de la imagen reconstruida. Es decir, al realizar la reconstrucción del holograma, la imagen real estará superpuesta con una imagen desenfocada o patrón de difracción procedente de la imagen virtual. Y esto implica cierto ruido de fondo sobre la imagen real, que es la imagen del objeto que queremos analizar. No obstante, existen algunos métodos de supresión de la imagen virtual (método de "phase-shifting", algoritmos de iteración entre imágenes gemelas, etc.) así como de minimización de su efecto (coherencia parcial, post-procesado digital, etc.) . En cualquier caso, la existencia de las imágenes gemelas es un problema que existe en los sistemas holográficos en línea que, dependiendo del caso, podrá ser más o menos crítico.

Matemáticamente, el principio de Gabor se enuncia del siguiente modo. Una onda esférica de longitud de onda 'A que emana de una fuente puntual o "pinhole" de iluminación con un diámetro del orden de la longitud de onda de la iluminación empleada, ilumina un objeto típicamente situado a una distancia corta (pocas miles de longitudes de onda) del "pinhole" de iluminación. De este modo, el objeto así iluminado produce un patrón de difracción con un aumento grande sobre una pantalla situada a distancia larga (decenas de milímetros) en comparación con la distancia entre el "pinhole" y el objeto. El aumento M proporcionado puede calcularse como:

M =~ (1)

Z siendo L la distancia que hay entre el "pinhole" de iluminación y la pantalla de detección, y Z la distancia existente entre el "pinhole" de iluminación y el objeto. Estas distancias pueden identificarse en la Figura 1, donde los diferentes elementos del microscopio se han referenciado como: Pi: "pinhole", R: pantalla de registro holográfico y o: muestra u objeto iluminado.

Si se llama A ( 7) a la amplitud de la onda de iluminación que llega al plano del objeto en un instante dado, siendo 7 el vector que indica la posición espacial, y suponiendo emisión constante dentro del cono de iluminación proporcionado por el "pinhole" de iluminación, dicha onda de iluminación puede subdividirse justo en el plano posterior al objeto y en aproximación de Gabor como suma de dos contribuciones: A ( 7) == Aret!. 7) + ~i~ 7) . Es decir, como suma de una onda de referencia que no se ve alterada por el objeto y sigue su propagación como si no hubiese objeto (Aret!. 7 ) = exp (ikr) /r, en teoría escalar de la difracción siendo k=21t/'A el número de onda) más una componente difractada por el objeto ~i~ 7 ) donde se asume que ~i~ 7) es mucho menor que AreR r) . Tanto AreR r) como AcliR r) pueden identificarse en la Figura 1. De este modo, la distribución de intensidades I ( r) que llega a la pantalla de detección en un instante dado puede calcularse como:

2 2 l (r) =IAr~r (r) + Adir (r) 1 =IAre¡ (r) 1 +IAdi{ (r) 1 + A;e¡ (r) Adif (r) + Arif (r) A;¡r (r) (2)

Los cuatro términos presentes en la ecuación 2 pueden identificarse como:

• Término 1: lA, .e¡ (r) 1 es la intensidad procedente del fondo de iluminación, es

decir, de la onda no alterada por el objeto y supone un fondo de intensidad sobre la imagen registrada en la pantalla de detección.

• Término 2: IAdif (r) 12 es la intensidad procedente de la difracción producida por

el objeto.

• Término 3: 4~{ (r) Adir (r) es el producto entre las amplitudes complejas de la

onda de referencia complejo-conjugada y la componente procedente de la difracción del objeto.

• Término 4: A, .~{ (r) A;if (r) es el producto entre las amplitudes complejas de la

onda de referencia y la componente complejo-conjugada procedente de la difracción del objeto.

Los términos 1 y 2 se corresponden con fondos de luz sobre el holograma registrado mientras que los términos 3 y 4 son términos interferenciales y tienen que ver con las imágenes real y virtual, respectivamente, cuando se realiza la reconstrucción del holograma.

Para llegar a la ecuación 2 ha sido necesario asumir que la onda originada por el objeto es mucho menor que la onda de referencia: AcliR r) « Aref ( r) . Solo bajo esta aproximación, es posible llegar a la ecuación 2 donde se dice que la holografía domina el proceso y es posible realizar reconstrucción holográfica del objeto. Esta situación se da cuando el objeto solo apantalla o bloquea una pequeña fracción de la luz sobre la pantalla de registro. Es lo que se suele conocer como aproximación de objeto poco difractivo y se produce cuando el objeto es esencialmente transparente o, incluso siendo opaco, presenta una baja proporción de zonas opacas en comparación con las transparentes. En caso contrario, no se puede asegurar que se está en régimen holográfico y no es posible realizar reconstrucción holográfica del objeto.

La adaptación comercial en el rango óptico de la idea de Gabor fue propuesta por Kreuzer y colaboradores en 2001 ([11]) . En el sistema de Kreuzer, básicamente, reemplazan la placa fotográfica del sistema de Gabor por un sensor digital (cámara CCD o sensor CMOS) y la iluminación de haces de electrones por luz visible.

Los contras del sistema Kreuzer son los mismos que en el concepto de Gabor, sin embargo existen numerosas ventajas derivadas del empleo de un sensor digital en la captura de los hologramas. Así por ejemplo, lo primero que se puede hacer es construir una imagen de contraste holográfica simplemente sustrayendo el fondo de iluminación del holograma registrado cuando si hay objeto. Esto supone una imagen de calibración inicial donde, sin presencia de objeto, se registra la imagen del fondo de referencia Are~ T ) Y su intensidad se resta de la intensidad proporcionada por el holograma registrado en presencia de objeto. Esto supone restar el término 1 directamente de la ecuación 2:

De este modo, las imágenes holográficas reconstruidas digitalmente poseen una contribución menos y, por lo tanto, menor ruido.

Obviamente, la imagen registrada por el sensor digital no es una imagen enfocada del objeto sino la interferencia de un patrón de difracción del objeto (es decir, algo desenfocado) con un haz de referencia de fondo. Dicho patrón desenfocado debe enfocarse digitalmente y para ello es fundamental que se esté en el régimen holográfico, es decir, objetos poco difractivos. Existen diferentes métodos para realizar el enfoque digital con diferentes características dependiendo de si se está en un sistema de alta o baja apertura numérica, de larga o corta distancia de propagación, etc. En cualquier caso, se trata de algoritmos de dominio público salvo en la patente de Kreuzer ([2]) donde sí se especifica un método de cálculo mediante una implementación rápida de la transformada de Kirchhoff-Helmhotz que permite evaluar Acti~ T) de manera exacta sin aproximaciones para diferentes distancias de propagación con el fin de construir una imagen 3D del objeto.

Sin embargo y como paso previo al enfoque digital, se suele realizar una corrección de la intensidad de la iluminación láser. Este paso sirve para homogenizar la intensidad en todo el holograma compensando las posibles variaciones de intensidad entre centro y periferia ocasionadas por una iluminación láser no constante. Simplemente implica una re-normalización de la intensidad que se calcula como:

1" (r) = I (r) -1' (r)

(4)

~I' (r)

Cuando en holografía se habla de reconstrucción se quiere decir que se obtiene la distribución compleja de amplitudes Acti~ T) a partir del holograma. La visualización de Adi~ T ) en un plano 20, es decir, perpendicular al eje óptico, proporciona o es equivalente a una única imagen enfocada del objeto (algo similar a lo que proporciona un microscopio convencional) . Pero gracias a la holografía, es posible generar una pila de imágenes 20 para diferentes distancias de propagación a partir de un único holograma registrado, de tal manera que se pueden combinar para proporcionar una imagen 30 del objeto que mejora su visualización.

Así pues, el algoritmo digital realizado por el sistema de Kreuzer puede resumirse en los siguientes pasos:

1. Registro del holograma digital (ecuación 2) .

2. Registro del fondo de iluminación sin objeto para generar holograma de contraste (ecuación 3) .

3. Corrección de la intensidad según la iluminación láser (ecuación 4) .

4. Reconstrucción numérica (algoritmo de propagación digital) a partir de la intensidad proporcionada por la ecuación 4 para enfocar...

1. Método de reconstrucción holográfico basado en microscopía sin lentes en línea con múltiples longitudes de onda, que comprende: -iluminar, de manera simultánea, un objeto (O) con luz divergente que incluye al menos tres longitudes de onda (J"l +A2 +A3 + ... ) ;

-registrar información holográfica de dicho objeto iluminado (O) que incluye patrones de difracción generados por dicho objeto (O) para dichas longitudes de onda (Al +A2 +A3 + ... ) , que son al menos tres; y

-obtener, por reconstrucción digital, una imagen holográfica compuesta a partir de al menos dicha información holográfica registrada; estando el método caracterizado porque comprende llevar a cabo dicha etapa de registro de información holográfica mediante el registro simultáneo para todas dichas longitudes de onda (Al +A2 +A3 + ... ) , que son al menos tres, de un holograma múltiple policromático, y obtener dicha imagen holográfica compuesta a partir de la información multiespectral incluida en dicho holograma múltiple policromático.

2. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende realizar dicha etapa de registro simultáneo en un solo disparo de la iluminación y con un único sensor digital (Rc) con sensibilidad a dichas longitudes de onda (Al +A2 +A3 + ... ) , que son al menos tres.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho sensor digital (Rc) tiene sensibilidad a dichas longitudes de onda (Al +A2 +A3 + ... ) , que son al menos tres, porque comprende una máscara o filtro o mosaico de celdillas con transmitancia espectral adaptada, comprendiendo el método la adaptación específica tanto de la transmitancia espectral como del número de celdillas de la máscara o filtro o mosaico a colocar sobre los píxeles del sensor digital al espectro y número de longitudes de onda (Al +A2 +A3 + ... ) elegidas para dicha etapa de iluminación simultánea, con el fin de que las celdillas transmitan en máximo el patrón de difracción proporcionado por cada una de las longitudes de onda (Al +A2 +A3 + ... ) de la iluminación.

4. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho sensor digital (Rc) tiene sensibilidad a dichas longitudes de onda (Al +A2 +A3 + ... ) , que son al menos tres, porque comprende una máscara o filtro o mosaico de celdillas con transmitancia espectral que permite el paso de la luz a dichas longitudes de onda (Al +A2 +A3 + ... ) , pero que carece de celdillas cuyas transmitancias espectrales estén adaptadas para transmitir en máximo el patrón de difracción proporcionado por al menos una de las longitudes de onda de la iluminación (Al +A2 +A3 + ... ) , que son al menos tres.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende realizar únicamente dicha iluminación simultánea con dichas longitudes de onda (j"1 +A2 +A3 + ... ) , que son al menos tres, sin requerir de iluminaciones adicionales del objeto (O) .

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende, para obtener dicha imagen holográfica compuesta, realizar un procesado digital de dicha información multiespectral relativa a al menos dichas tres longitudes de onda (A1 +A2 +A3 + ... ) , e incluida en unos respectivos canales, que incluye realizar al menos una mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros correspondientes a cada longitud de onda.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho procesado digital comprende utilizar dicha información multiespectral para eliminar la contribución de la imagen virtual en dicha imagen holográfica compuesta.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque dicho holograma registrado es un único holograma multicromático o multiespectral, y porque dicho procesado digital incluye una primera etapa que comprende realizar de manera secuencial:

-una separación de la información correspondiente a cada longitud de onda incluida en dicho holograma multicromático o multiespectral, obteniendo al menos tres correspondientes hologramas monocromáticos, uno por longitud de onda o canal;

-una ecualización inicial o corrección de intensidad de los tres hologramas monocromáticos según la iluminación empleada para cada canal;

-una eliminación de contribuciones cruzadas no deseadas entre canales;

-una propagación digital y enfoque de cada canal por separado hasta el plano del objeto; y

-dicha mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros de al menos tres hologramas monocromáticos, una vez enfocados, para la generación de dicha imagen holográfica compuesta a partir de al menos tres canales.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho procesado digital incluye una segunda etapa que comprende realizar de manera secuencial y en bucle un algoritmo de iteración de fase:

-una propagación digital de dicha imagen holográfica compuesta al plano de registro con las distancias de propagación previamente calculadas para cada canal, generando así al menos tres nuevos hologramas del objeto desenfocado;

-un almacenamiento, en estos al menos tres nuevos hologramas generados, de la fase generada en la propagación digital para cada uno de los al menos tres canales,

y una sustitución de la amplitud obtenida en la propagación digital para los al menos tres canales por la registrada inicialmente para cada uno de los al menos tres canales; -una propagación digital de al menos dichos tres nuevos hologramas hasta el plano del objeto, cada uno con su correspondiente distancia de propagación; y

-una mezcla ponderada en el dominio de Fourier de los espectros de los tres nuevos hologramas para generar una nueva imagen holográfica compuesta que, en función de su resolución y ruido:

-se selecciona como imagen final; o

-vuelve a introducirse en dicho bucle hasta que tenga una resolución y

ruido determinados.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende disponer a dicho objeto (O) más próximo a una fuente de luz (Pi) con la que se realiza dicha iluminación del mismo, que a unos medios de registro (Rc) con los que se realiza dicho registro del holograma multiespectral.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichas longitudes de onda (1-"1 +/...2 +/...3 + ... ) , que son al menos tres, se encuentran en un espectro visible por el ojo humano.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque al menos una de dichas longitudes de onda (/...1 +/...2 +/...3 + ... ) , que son al menos tres, se encuentra en un espectro no visible por el ojo humano.

13. Microscopio holográfico sin lentes en línea basado en múltiples longitudes de onda, que comprende:

-medios de soporte configurados y dispuestos para soportar un objeto (O) ;

-medios de iluminación divergente (Pi) configurados y dispuestos, en relación a dicho objeto (O) soportado por dichos medios de soporte, para iluminar, de manera simultánea, dicho objeto (O) con luz que incluye al menos tres longitudes de onda (A1 +/...2 +/...3 + ... ) ;

-medios de registro (Rc) configurados y dispuestos, en relación a dicho objeto

(O) soportado por los medios de soporte, para registrar información holográfica de dicho objeto iluminado (O) que incluye patrones de difracción generados por dicho objeto (O) para dichas longitudes de onda (/...1 +/...2 +/...3 + ... ) , que son al menos tres; y

-medios de procesamiento (pe) , en conexión con dichos medios de registro (Rc) para recibir de los mismos al menos dicha información holográfica registrada, y configurados para obtener, por reconstrucción digital, una imagen holográfica compuesta a partir de dicha información holográfica registrada;

estando el microscopio caracterizado porque: dichos medios de registro (Re) están configurados y dispuestos para el

registro simultáneo para todas dichas longitudes de onda (A, 1 +A, 2 +A, 3 + ... ) ,

que son al menos tres, de un holograma múltiple policromático de dicho objeto iluminado (O) ;

y porque dichos medios de procesamiento (PC) están configurados para obtener, por reconstrucción digital, dicha imagen holográfica compuesta a partir de la información multiespectral incluida en dicho holograma múltiple policromático.

14. Microscopio según la reivindicación 13, caracterizado porque dichos medios de registro (Re) comprenden un único sensor digital policromático con sensibilidad a dichas longitudes de onda (A, 1 +A, 2 +A, 3 + ... ) , que son al menos tres, y unos medios de control que controlan al sensor digital policromático para realizar dicho registro simultáneo para todas las longitudes de onda, en un solo disparo de iluminación.

15. Microscopio según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque dichos medios de procesamiento (PC) implementan el procesado digital del método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.

16. Microscopio según la reivindicación 14, caracterizado porque dichos medios de registro (Re) comprenden una máscara o filtro o mosaico de celdillas con transmitancia espectral adaptada a dichas longitudes de onda (A, 1 +A, 2 +A, 3 + ... ) , que son al menos tres, dispuesta o dispuesto frente a dicho sensor digital policromático.

17. Microscopio según la reivindicación 16, caracterizado porque tanto la transmitancia espectral como el número de celdillas de dicha máscara o filtro o mosaico, a colocar sobre los píxeles del sensor digital policromático, están adaptados específicamente al espectro y número de dichas longitudes de onda (A, 1 + A, 2 + A, 3 + ... ) , que son al menos tres, con el fin de que las celdillas transmitan en máximo el patrón de difracción proporcionado por cada una de las longitudes de onda (A, 1 +A, 2 +A, 3 + ... ) de la iluminación.

18. Microscopio según la reivindicación 16, caracterizado porque la transmitancia espectral de las celdillas de dicha máscara o filtro o mosaico, a colocar sobre los píxeles del sensor digital policromático, permite el paso de la luz a dichas longitudes de onda (A, 1 +A, 2 +A, 3 + ... ) , que son al menos tres, pero la máscara o filtro o mosaico carece de celdillas cuyas transmitancias espectrales estén adaptadas para transmitir en máximo el patrón de difracción proporcionado por al menos una de dichas longitudes de onda (A, 1 +A, 2 +A, 3 + ... ) , que son al menos tres.

19. Microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizado porque dichos medios de iluminación divergente (Pi) comprenden una fuente puntual de luz compuesta por dichas longitudes de onda (1., , 1 +/...2 +/...3 + ... ) , que son al menos tres.

20. Microscopio según la reivindicación 19, caracterizado porque dichos medios de iluminación divergente (Pi) comprenden.

5. una fuente de iluminación multiespectral estenopeica; o

-al menos tres fuentes de luz láser, una por longitud de onda, acopladas a la entrada de una guía de fibra óptica con una salida configurada para proporcionar iluminación divergente para todas las longitudes de onda, que son al menos tres; o

-un sistema de iluminación basado en filtros dicroicos de combinación de al 10 menos tres diferentes longitudes de onda junto con sistemas ópticos de focalización de luz; o

-un sistema emisor láser de tres o más longitudes de onda ensamblados en un único soporte físico, como es el caso de algunas latas de diodo con capacidad de emisión en 405/660/780 nanómetros, y cualquier tipo de elementos redireccionadores

de la luz para su apropiado manejo.

21. Programa de ordenador que incluye instrucciones de código que cuando se ejecutan en un ordenador implementan el procesado digital del método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.