Método de genotipado simultáneo de polimorfismos y/o mutaciones.

Método de genotipado simultáneo de polimorfismos y/o mutaciones.

La presente invención se refiere a un método de discriminación alélica para la detección de polimorfismos genéticos y/o mutaciones, especialmente polimorfismo de un único nucleótido, que comprende una ligación alelo-específica, posterior amplificación con cebadores universales, hibridación con sondas ancladas sobre una superficie, preferiblemente la superficie de un disco óptico, y la detección de los polimorfismos y/o mutaciones, preferiblemente mediante un lector de disco óptico.

La presente invención se refiere a un método de genotipado de polimorfismos, preferiblemente polimorfismos de un único nucleótido, u otro tipo de mutaciones que comprende una etapa de ligación alelo-específica, una amplificación con cebadores universales, una hibridación con sondas ancladas a un soporte y la detección de los productos formados específicos de dichos polimorfismos y/o mutaciones. La presente

invención se puede encuadrar en el ámbito de la biomedicina y de la industria agroalimentaria.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los polimorfismos de un único nucleótido (SNPs) son mutaciones puntuales en el genoma, de modo que en una misma posición del ADN genómico existen diferentes variantes denominadas alelas y la abundancia del alelo menos frecuente es igualo mayor que el 1%. Los SNPs situados en regiones codificantes del genoma pueden alterar la estructura y función de las proteínas, lo que puede traducirse en cambios a nivel fenotípico. Numerosos estudios han establecido asociaciones entre la presencia de un determinado alelo y el fenotipo observado. Por tanto, los SNPs tienen importantes aplicaciones como marcadores, entre las que destacan las biomédicas: empleo con fines diagnósticos, para establecer el riesgo de un individuo a padecer una enfermedad, o en farmacogenética.

En la actualidad hay disponibles diversas metodologías de genotipado de polimorfismos y otras mutaciones que se basan en diferentes reacciones de discriminación alélicas tales como la hibridación alelo-específica (ej. Genechips® de Affymetrix) o la extensión de cebadores y posterior ligación (ej. Goldengate® de IlIumina®) . No obstante, existe una demanda de nuevas tecnologías que superen a las ya desarrolladas en: -Escalabilidad, es decir, el número de polimorfismos interrogados debe de adaptarse a las necesidades de cada problema genético concreto. -Capacidad de multiplexado, suficiente (10-100 SNPs) para que se puedan sacar

conclusiones clínicas a partir de los resultados obtenidos.

-Método versátil, que pueda ser empleada con diferentes fines sin necesidad cambios importantes. -Plataforma de detección portátil, de fácil manejo y más simple, que permita hacer uso de la tecnología en el lugar de interés ("Point of Care") y no únicamente en

laboratorios bien dotados. -Protocolo de trabajo corto, que pueda llevarse a cabo en una jornada laboral o menos.

En la actualídad no se dispone de una herramienta que comprenda todas las 10 características anteriormente señaladas.

Entre los métodos que permiten la detección de SNPs, serían por ejemplo los descritos en US20030215825. Esta aproximación requiere el empleo de sondas específicas lo que presenta desventajas como la posible reactividad cruzada o el 15 multiplexado limitado, por tener que emplear condiciones de hibridación comunes entre ellas. Además, se limita exclusivamente al empleo de partículas como marcadores para la detección. US2012252700 incluye una amplificación y posterior ligación alelo-específica, siendo la capacidad de multiplexado de la técnica de aproximadamente entre 3 y 20 SNPs. US20120270272 describe la metodología de 20 discriminación basada en ligación alelo-específica y posterior amplificación por PCR universal utilizando oligonucleótidos específicos modificados con un grupo tiofosfato o azúcares y preferentemente ligasas termoestables. Esta metodología utiliza ligasas termoestables que no pueden ser inactivadas por un tratamiento térmico posterior (Iigasas Taq o de Pyrococcus) , por lo que durante la amplificación continúan los eventos de ligación y, en consecuencia , alterando la formación de productos de los diferentes SN Ps.

Entre las técnicas versátiles y portables por ahora conocidas para el análisis de ácidos nucleicos se encuentra, por ejemplo, el empleo de discos ópticos como soporte para 30 anclar biomoléculas y de lectores/grabadores de discos como detectores para estudiar diferentes biointeracciones (por ejemplo EP1324042, ES2304093A 1, Santiago et al. (2014) , Sensors and Actuators B: Chemical, 204, p. 273-281) . Se han descrito técnicas de discriminación de SNPs mediante hibridación alelo-específica sobre discos ópticos, donde la hibridación se realiza generalmente con oligonucleótidos 35 sintéticos, por ejemplo, Morais et al. (2006) Chemical Communications, 22, p. 2368-2370 (sólo un SNP) , Sañuls et al. (2008) Bioconjugate Chemistr y , 19, (3) , p.

665-672 Y Yu el al. (2013) Acc. Chem. Res. , 46 (2) , p. 258-268. Sín embargo, hasta ahora no se ha demostrado que esta técnica permita el genotipado masivo de SNPs. La principal causa es que cada polimorfismo, debido a su propia naturaleza y a los nucleótidos de su entorno, requiere unas condiciones específicas para su correcta discriminación. Por ello, establecer unas condiciones que permitan diferenciar simultáneamente un gran número de SNPs mediante este método resulta muy complejo.

Por lo tanto, se hace necesario un método robusto para la detección simultánea de 10 SNPs u otras mutaciones, con capacidad de multiplexado suficientemente elevada, escalable, más simple y con un protocolo de trabajo corto.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

En la presente invención se ha combinado un método de discriminación alélica, basado en ligación alelo-específica, y posterior amplificación con cebadores universales, con una detección por hibridación con sondas ancladas sobre una superficie, preferiblemente de un disco óptico bien sea CD, DVD, Blu-ray, etc. y utilizando un lector/grabador de discos ópticos. Esta aproximación preferente hace que la metodología presentada aúne la alta fidelidad y la capacidad de multiplexado de la discriminación por ligación y la amplificación-hibridación con cebadores y sondas universales, con las características propias de la detección basada en la tecnolog ía de discos ópticos, tales como portabilidad, facilidad de manejo y bajo coste. Así, esta invención aporta un sistema robusto, analíticamente poderoso, fiable y

económicamente competitivo de genotipado, que puede ser aplicado a gran escala en centros de salud , industrias, laboratorios o en situaciones de emergencia o críticas. El método de la presente invención se enmarca dentro de las metodologías de genotipado de polimorfismos u otras mutaciones, permitiendo un multiplexado suficiente para aplicarse efectivamente al ámbito clínico (por ejemplo en medicina personalizada) y el agroalimentario (por ejemplo para la autenticación de alimentos, tanto animales como vegetales) , especialmente, y es fácil de ubicar en los lugares de interés (POC, "Point of care") . El método descrito es, por tanto, una clara alternativa a los métodos más largos y excesivamente caros, disponibles actualmente a nivel comercial para el genotipado de un número medio de mutaciones.

El método de la presente invención también puede ser útil en el ámbito medioambiental (por ejemplo para la identificación de especies animales o vegetales)

yen el forense (para identificación de individuos) , entre otros.

La presente invención describe un método para el genotipado simultáneo de mutaciones, preferiblemente polimorfismos genéticos, especialmente polimorfismos de un único nucleótido (o SNPs, Single Nucleotide Polymorphism) , también llamados polimorfismos de nucleótido simple.

El término "polimorfismo genético" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de la cadena de ácido desoxirribonucleico (AON) que tiene al menos una frecuencia del 1% en los individuos de una población. Los polimorfismos genéticos pueden ser variaciones de uno o varios nucleótidos. Particularmente, los polimorfismos de un solo nucleótido generalmente dan lugar a dos alelos. El

genotipado de SNPs proporciona información sobre la variación de un solo polimorfismo o la información de un haplotipo (SNP etiquetas o "tagSNP") .

"Haplotipo" es una combinación de alelos de diferentes loci de un cromosoma que son trasmitidos juntos. Un haplotipo puede ser un locus, varios loci, o un cromosoma entero dependiendo del número de eventos de recombinación que han ocurrido entre un conjunto dado de loci. En la presente invención nos referimos a "haplotipo" como un conjunto de polimorfismos (SNPs) que se heredan en bloque con unas medidas de desequilibrio de ligamiento r22::0, 8 y que se identifican mediante el genotipado de uno de los polimorfismos incluidos en dicho haplotipo. Por lo tanto, el método de la presente invención permite la detección de un determinado polimorfismo y/o haplotipo en un individuo.

La presente invención emplea una técnica de discriminación alélica que comprende una ligación alelo-específica (mediante la acción... [Seguir leyendo]

1. Método de detección de al menos un polimortismo genético u otra mutación,

preferiblemente de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) , en una muestra 5 aislada de un sujeto que comprende los siguientes pasos:

a. ligación alelo-específica entre oligonucleótidos en disolución o en fase sólida;

b. amplificación de al menos un producto de ligación obtenido en el paso (a) ,

donde la amplificación se rea liza utilizando al menos un cebador universal 10 en disolución o en fase sólida;

c. hibridación de al menos un producto amplificado obtenido en el paso (b) con al menos una sonda, donde la sonda esta fijada en una superficie; y

d. detección del polimortismo y/o mutación del producto obtenido en el paso (e) .

2. Método según la reivindicación 1 donde los polimortismos y/o mutaciones detectados simultáneamente son entre 5 y 200; preferiblemente son entre 15 y

100.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde cada ligación del paso (a) se realiza mediante al menos un oligonucleótido discriminante y un oligonucleótido común.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la ligación tiene lugar

en fase sólida, y al menos uno de los oligonucleótidos está anclado en la superticie.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde entre el paso (a) de la ligación y el paso (b) de la amplificación se realiza un paso de inactivación,

preferiblemente el paso de activación se lleva a cabo .

9. 99 oC, preferiblemente a 98°C, durante entre 3-10 minutos, preferiblemente 5 minutos.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la amplificación del paso (b) se realiza mediante reacción en cadena de la polimerasa y/o reacción de amplificación isoterma, preferiblemente amplificación recombinasa polimerasa o amplificación por desplazamiento de hebra, en fase sólida.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la amplificación del paso (b) se realiza utilizando nucleótidos marcados y/o cebadores marcados; preferiblemente los marcadores son antígenos, partículas o fluoróforos.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde los oligonucleótidos, sondas y/o cebadores anclados sobre la superficie son específicos, genéricos o comprenden una región específica y una genérica.

9. Método según la reivindicación 8 donde el anclaje sobre la superficie se realiza, en 10 formato de micromatriz, preferiblemente además incluye controles.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la superficie en la que se anclan los oligonucleótidos, sondas, y/o cebadores, es un disco óptico o disco compacto, y la detección (paso (d» se realiza utilizando lectores de disco óptico o disco compacto.

11. Método según la reivindicación 1 O donde los discos se seleccionan de la lista que consiste en: CD, DVD, Slu-ray, sin modificar o modificada, que preferiblemente comprenden superficies tratadas o discos ópticos multicapa.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 donde la detección se realiza de una partícula, un depósito metalográfico, un depósito enzimático o un compuesto coloreado.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde el sujeto es un organismo, mezcla de organismos o sus derivados, preferiblemente es un humano.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la muestra aislada se selecciona de la lista que consiste en: sangre, suero, plasma, linfa, orina, saliva, lavado broncoalveolar, esputo, líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, tejido y secreción lacrimal.

15. Método según la reivindicación 14 donde la muestra es fresca, congelada, fijada o 35 fijada y embebida en parafina.