Método de diagnóstico para detectar la lesión renal aguda a través del uso de la proteína de choque térmico de 72 como un biomarcador sensible.

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico, no invasivo,

confiable y de fácil realización para detectar insuficiencia renal aguda temprana a través de medir Ia concentración de un biomarcador en muestras de orina, seleccionado a las proteínas de choque térmico de Ia familia 70 KDa, más específicamente se refiere a Ia identificación de Ia proteína de choque térmico 72 y Ia identificación de este biomarcador es detectado mediante ELISA y Western blot o bien el nivel de RNAm mediante RT-PCR en tiempo real. Esta invención contribuye a solucionar el problema que existe actualmente en Ia clínica de no poder detectar desde etapas tempranas a Ia Insuficiencia Renal Aguda y Ia intensidad del daño renal para así y poder intervenir oportunamente al paciente con una terapia efectiva.

Método de diagnóstico para detectar la lesión renal aguda a través del uso de la proteína de choque térmico de 72 como un biomarcador sensible.

Campo de la invención

La presente invención se inscribe en el campo de la medicina clínica y se refiere a un método de diagnóstico para detectar Insuficiencia Renal Aguda (AKI), más específicamente se refiere a la demostración de que la proteína de choque térmico de 72 kDa (Hsp72) es un biomarcador no invasivo, sensible y temprano para detectar AKI y a los métodos para detectar a Hsp72 en muestras de orina.

Antecedentes de la invención

La Insuficiencia renal aguda es una causa importante de morbilidad y mortalidad en los pacientes hospitalizados por diferentes causas. Se calcula que la incidencia de la AKI varía del 5% en pacientes con función renal normal antes de alguna cirugía, hasta un 30%, en pacientes admitidos en unidades de cuidado intensivo (ICU). A pesar de los recientes avances en el diagnóstico y la terapéutica, la morbilidad y mortalidad asociada con AKI sigue siendo muy elevada (40 a 60% en pacientes en ICU) y no ha sido mejorada en forma considerable en las últimas cuatro décadas, debido principalmente a que las herramientas disponibles para la detección temprana de la AKI son poco sensibles e inespecíficas (Clin J Am Soc Nephrol 3:1895-1901,2008). Debido a esto, la búsqueda de biomarcadores tempranos está ganando gran importancia. Por otra parte, estos nuevos biomarcadores podrían ser herramientas potenciales para la detección temprana de AKI y podrían ser también capaces de distinguir diferentes grados de lesión renal con el fin de detectar aquellos pacientes que están en riesgo de desarrollar enfermedad renal crónica, debido a un episodio severo de AKI. Por lo tanto, el desarrollo de biomarcadores efectivos ayudará a la intervención oportuna para un tratamiento adecuado de la AKI, en los pacientes expuestos a desarrollarla como lo son los pacientes en las ICU, los que serán sometidos a cirugía cardiaca, pacientes de trasplante renal o aquellos que hayan desarrollado AKI y que el biomarcador permita estratificar la lesión, así como a detectar aquellos pacientes que estén en riesgo de desarrollar enfermedad renal crónica.

En la práctica clínica el diagnóstico de la AKI se establece con base en las elevaciones de la creatinina en suero y por estimaciones de la tasa de filtrado glomerular (GFR). A pesar de que la creatinina en suero es útil para la estimación de la función renal en pacientes con enfermedad renal crónica, en pacientes con AKI, no es un buen indicador por las siguientes tres razones: 1) Una gran cantidad del tejido renal puede estar lesionado sin elevaciones de la creatinina en suero, un claro ejemplo se presenta los donadores en el trasplante renal, que a pesar de perder el 50% de la masa renal no presentan cambios en los niveles de creatinina en suero, 2) La concentración de la creatinina en suero depende de varios factores como no renales tales como; la conversión de creatina a creatinina en el músculo esquelético, la liberación de la creatinina al torrente sanguíneo, etc., por lo que la elevación de la creatinina en suero se da de forma tardía porque depende de su liberación y acumulación y 3) La creatinina en suero puede estar influenciada por otros factores como; el peso, la raza, el género, la edad, el consumo de fármacos, el metabolismo muscular y la ingesta proteica. En cuanto a la determinación de la GFR, esta puede ser modificada por lesiones de tipo renal y no renal. Por ejemplo; la hipovolemia o alteraciones del grado de vasoconstricción o vasodilatación de la arteriola aferente causan una reducción en la TFG con una consecuente elevación de la creatinina en plasma, lo que no se correlaciona con daño tubular o renal. Todos estos factores dificultan la intervención temprana de los pacientes que desarrollan AKI y en consecuencia no se alcanza una mejor prognosis (Clin Transi Sci 3,200-208; 2008).

Un biomarcador es una molécula biológica que se produce endógenamente y que puede ser un indicador objetivo para detectar un proceso biológico anormal. Adicionalmente puede ayudar a detectar si una intervención farmacológica está siendo útil para reducir la lesión provocada por el proceso patológico.

Específicamente, en pacientes con AKI, un biomarcador útil será aquel que ayude a detectar en forma temprana, precisa y sencilla la principal complicación estructural de la AKI que es la necrosis tubular aguda (ATN). La ATN se caracteriza por lesión tubular proximal severa debido a la pérdida del borde en cepillo y de la polaridad en el epitelio. Por estas características, es posible encontrar un biomarcador que se pueda detectar en las células desprendidas y que aparecerán en la orina, pudiendo de esta forma reflejar la lesión tubular asociada con este síndrome.

Los biomarcadores no solo ayudarán a diferenciar la ATN de otros tipos de lesión renal, sino que potencialmente pueden identificar la localización del daño tubular, la causa y el curso temporal de la lesión.

Varios estudios han propuesto proteínas y marcadores bioquímicos para la detección de ANT, dentro de los que se encuentran: la N-acetil-b-D-glucosamlnldasa (NAG), la lipocalina de neutrófllos asociada a la gelatinasa (NGAL), la molécula de lesión renal -1 (Kim-1), la cistatina C y la ¡nterleuclna 18 (IL-18) (Am J Physiol Renal Physiol 290:F517- F529) (J Am Soc Nephrol 18:904-912, 2007) (Am J of Tranplantatlon 6:1639-1645;2006). En un informe reciente, realizado con 90 pacientes que fueron sometidos a cirugía cardiaca, se evaluó la utilidad diagnostica de Kim-1, NAG y NGAL. Al determinar la capacidad de estas moléculas para la detección de AKI en forma inmediata o después de 3 horas de la cirugía cardiaca, utilizando una escala de 1, se encontró que la capacidad de Kim-1 fue 0.68 y 0.65 respectivamente, para NAG: 0.61 y 0.63 y para NGAL: 0.59 y 0.65. Para aumentar la sensibilidad de estos marcadores fue necesario combinar la determinación de estos tres marcadores, y de esta forma, tanto la sensibilidad como, la detección temprana de AKI, se incrementó a 0.75 y 0.78, respectivamente (Clin J Am Soc Nephrol 5;873- 882, 2009). Esto apoya la ¡dea de que se debe continuar con la búsqueda de biomarcadores con un mayor nivel de potencial de diagnóstico temprano y capaces de estratificar el daño por AKI.

Se ha informado de que durante los fenómenos de AKI, son activados varios mecanismos para compensar el estrés celular resultante, uno de ellos es el incremento en la expresión de la familia de proteínas de choque térmico (Hsp) (Experíentla 18, 571-573, 1962) que ayudan a recuperar la homeostasls celular. Estas proteínas pertenecen a una familia multlgénlca con un peso molecular que varía entre los 10 hasta 150 kDa. Estas proteínas se clasifican de acuerdo con su peso molecular en 6 subfamilias: de 100-110 kDa, 90 kDa, 70 kDa, 60 kDa, de 40 kDa y la subfamilia de Hsp con peso molecular entre 18 y 30 kDa {Ann Med. 4:261-71, 1999).

En particular la familia de las Hsp70 se compone de 4 ¡soformas, la Grp78, la mHsp95, Hsc70 y la ¡soforma ¡nduclble: Hsp72. Ésta última se expresa en respuesta al estrés celular y su Inducción puede llegar a ser tan alta como el 15% de la proteína celular total (Cell Stress chaperones 4;309-316, 2003). Este hecho, en conjunto con la descamación celular del túbulo proximal de la nefrona que ocurre ante un fenómeno de AKI, fue utilizado como base para esta Invención: que es la detección urinaria de Hsp72, como un blomarcador sensible de AKI, tanto a nivel de proteína, usando inmunoensayos y en el nivel de ARNm usando la reacción en cadena de la polímerasa en tiempo real (PCR en tiempo real).

Müller divulga la detección de Hsp70/72 en la orina de niños sometidos a trasplantes y las ratas sometidas a isquemia (Müller T et al. "Urinary Heat Shock Protein-72 Excretion in Clinical and Experimental Renal Ischemia", Pediatric Nephrology, 2003, 18, 2, 97-99) Sin embargo, no demuestra la lesión renal en los niños sometidos a trasplantes. El posible daño renal debería ser evaluado, bien sea por la creatinina en suero incrementada o por evaluación histopatológica, que faltan en la publicación. Una situación similar ocurre con los animales de experimentación: los ensayos se realizaron en ratas sometidas a isquemia, tampoco mostraron daño renal. El documento no evalúa que la presencia de Hsp72 en la orina refleja cualquier grado de anormalidad funcional o estructural en el riñón, contrario de la presente invención. De hecho, de los niños sometidos a trasplante solamente los resultados de orina de tres de ellos son denominados, y estos sin especificar qué tipo de donante son, ya sea de donante vivo o de cadáver. Esto no apoya consideraciones... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección temprana de la lesión renal aguda, que comprende determinar la concentración de proteína de choque térmico 72 (Hsp72) como biomarcador en una muestra de orina obtenida de un mamífero.

5 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho mamífero es humano.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha Hsp72 en la muestra de orina se detecta después de tres horas después de que la lesión ha sido provocada en el riñón.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha concentración de proteína de choque térmico 72 permite estratificar la intensidad de la lesión provocada por periodos incrementados de la lesión renal

10 aguda.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración del biomarcador se determina en el nivel de ARNm usando inmunoensayos.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de biomarcador se determina en el nivel de proteína usando inmunoensayos.