Método de detección de cáncer colorrectal.

Un método para detectar una predisposición a, o la incidencia de,

cáncer colorrectal en una muestra fecal, que comprende:

(a) detectar la presencia de sangre en la muestra fecal, en donde la detección de la presencia de sangre es indicativa de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal; y

(b) detectar una modificación epigenética en el ADN contenido dentro de la muestra fecal, en donde la modificación epigenética es detectada en al menos un gen seleccionado entre NDRG4, PHACTR3, FOXE1, GATA4, GPNMB, TFPI2, SOX17, SYNE1, LAMA, MMP2, OSMR, SFRP2 y CDO1 y en donde la detección de la modificación epigenética en al menos uno de los genes es indicativa de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal y sobre la base de un resultado positivo obtenido en (a) o (b) o tanto en (a) como en (b) detectar una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal.

Método de detección de cáncer colorrectal Campo de la invención

La presente invención se refiere al diagnóstico, la estadificación y el tratamiento de enfermedades, en particular cáncer y más específicamente cáncer colorrectal. La invención se refiere a métodos y kits para el diagnóstico del cáncer colorrectal basándose en la detección de modificaciones epigenéticas, típicamente en genes específicos. Los métodos y kits también pueden permitir la detección de sangre en una muestra fecal, demostrándose los ensayos combinados particularmente ventajosos.

Antecedentes de la invención

El cáncer colorrectal (CCR) es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, y es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos. El pronóstico de los pacientes es bueno si el cáncer se detecta a tiempo, cuando el sitio del cáncer está confinado a su lugar de origen. Sin embargo, las tasas de curación caen una vez que el cáncer se ha diseminado. La mayoría de los cánceres de colon surgen de pólipos adenomatosos convencionales (secuencia convencional de adenoma a carcinoma), mientras que algunos cánceres de colon parecen surgir del pólipo adenomatoso dentado reconocido recientemente (teoría de adenoma dentado a carcinoma). Debido a que los adenomas convencionales y adenomas serrados son generalmente asintomáticos, el escrutinio en masa de pacientes asintomáticos se ha convertido en la piedra angular para la detección y la eliminación de estas lesiones precursoras para reducir el riesgo de cáncer de colon.

Están disponibles varios métodos diferentes de escrutinio para CCR. Procedimientos tales como el examen rectal digital (DRE); la colonoscopia o la sigmoidoscopia son altamente invasivos, dolorosos y pueden causar una gran cantidad de molestias al paciente. Otros ensayos de escrutinio menos invasivos incluyen pruebas de sangre oculta en materia fecal (PSOMF); prueba inmunoquímica fecal (PFI); enema de bario con contraste de aire; colonoscopia virtual; biopsia (p. ej., biopsia con aguja guiada por TC); y técnicas de imágenes (p. ej., ecografía, barrido por TC, barrido mediante TEP, y MRI).

La colonoscopia se ha convertido en la prueba de escrutinio primario para CCR debido a su alta sensibilidad y especificidad, y capacidad de realizar polipectomía. Si bien sensible y específico, el procedimiento es invasivo, costoso, tiene disponibilidad limitada e Incluye ciertos riesgos, como la inducción de infección y la perforación del intestino.

Un modo de escrutinio de CCR de uso común y menos costoso es una prueba de sangre oculta en materia fecal (PSOMF), que pone a prueba la presencia de sangre en las heces. La presencia de la hemoglobina como una proteína de la sangre representativa en las heces es un indicador de sangrado intestinal, que se asocia frecuentemente con el CCR. Sin embargo, puesto que oculta en una muestra fecal podría ser indicativo de una variedad de trastornos gastrointestinales, siguen siendo necesarios más exámenes médicos tales como la colonoscopia para identificar el cáncer colorrectal.

Las pruebas de sangre oculta en materia fecal se clasifican principalmente en dos categorías, las pruebas basadas en el uso de reactivos químicos cromogénicos tales como las pruebas con goma de guayaco e inmunoquímicas. Los métodos con guayaco basados químicamente determinan la presencia de sangre oculta mediante la detección de la actividad peroxidasa de la hemoglobina en la sangre presente en la muestra de materia fecal. Requieren la catálisis de peróxido a oxígeno y agua, y la posterior oxidación de un colorante incoloro (más a menudo a una forma coloreada). Sin embargo, también se encuentra actividad peroxidasa en carnes y verduras. Con el fin de producir resultados exactos, estas pruebas requieren restricción de la ingesta de ciertos alimentos, medicamentos, vitaminas y otras sustancias antes y durante el período de recogida de las muestras. La sensibilidad de la PSOMF con guayaco más comúnmente utilizada (Hemoccult) es de aproximadamente 5%. A pesar de una especificidad del 98%, el valor predictivo positivo para la PSOMF es bajo. Métodos de detección de sangre oculta basados en análisis de porfirina (hemo y protoporfirina IX) o ensayos inmunológicos utilizando anticuerpos anti-hemoglobina mejoran estos resultados. Los ensayos inmunoquímicos (PFI o ¡PSOMF) que utilizan anticuerpos anti-hemoglobina específicos para la sangre humana en extractos de heces no requieren restricciones dietéticas; sin embargo, son más complicados y más caros que los ensayos basados en peroxidasa. Además, la hemoglobina humana en muestras fecales se degrada con el tiempo, dando como resultado una pérdida de antigenicidad que puede producir resultados falsos negativos. La sensibilidad notificada de estas pruebas inmunológicas varía ampliamente, pero es típicamente de 6-8%, dependiendo de la población sometida a ensayo. La especificidad se estima en -98%. Debido a la naturaleza intermitente del sangrado colorrectal, la sensibilidad de la PSOMF y la PFI es directamente proporcional al número de muestras tomadas y la frecuencia de las pruebas.

Los recientes desarrollos en los ensayos buscan específicamente mutaciones en los ADN característicos de la

neoplasia colorrectal que son detectables en las células epiteliales exfoliadas en las heces (Pignone, et al., 22; Ahlquist, et al., 22). Si bien el sangrado neopláslco es Intermitente, el desprendimiento epitelial es continuo, lo que podría hacer los ensayos de ADN basados de heces (es decir, también conocidos como ensayos de ADN fecal [ADN-f] y de ADN en heces [DNA-h]) pruebas más sensibles que otros métodos. Los primeros estudios de escrutinio molecular fecal se centraron principalmente en las mutaciones Individuales. Las mutaciones genéticas en P53, K-ras, y BAT 26, por ejemplo, se han relacionado con el cáncer colorrectal y siguen siendo detectables en muestras fecales. Las neoplasias colorrectales son variadas en la naturaleza y no se ha Identificado que ninguna mutación única sea expresada universalmente. Por esta razón, se utilizan preferiblemente paneles de análisis de la diana múltiples (MTAP). PreGen-Plus (EXACT Sciences Corporation, Maynard, MA; Laboratory Corporation of America, Burlington, Carolina del Norte) es una única prueba que Identifica la presencia de 23 mutaciones del microsatélltes (MSI) diferentes que se sabe que están asociadas con el CCR, Incluyendo mutaciones en BAT- 26. Además, otras 21 mutaciones puntuales en otros genes asociados con el CCR están Incluidas en este ensayo APC, K-ras, y p53. Este ensayo está diseñado adicionalmente para detectar fragmentos de ADN largos, que han sido asociados específicamente con células llamadas colonocltos no apoptótlcos, que son comunes en el CCR. Si bien este ensayo es más sensible que la prueba de sangre oculta en materia fecal, no es tan sensible como la colonoscopla y se perderá aproximadamente la mitad de los cánceres en un grupo de riesgo medio de personas sin síntomas.

El aumento de la metilación del ADN es una alteración eplgenétlca que es común en los cánceres humanos y a menudo está asociado con el silenciamiento transcrlpclonal. El ADN metllado aberrantemente también se ha propuesto como marcador tumoral potencial para el escrutinio del CCR. Genes tales como la vimentlna, que son transcrlpclonalmente silenciosos en el epitelio normal, han sido considerados como dianas para la metilación aberrante asociada al cáncer y para su uso como marcadores del cáncer (JNCI Journal of the National Cáncer Instltute 25 97(15): 1124-1132). Un ensayo combinado utilizando el gen de la vimentina (hV) hipermetllado y un análisis de Integridad del ADN de dos sitios (DY), demostró una sensibilidad de 88% para el CCR con una especificidad de 82% (Am J Gastroenterol. 28 Nov; 13(11): 2862-7). Adlclonalmente, ColoSure® es un ensayo de ADN basado en heces, desarrollado en el laboratorio con un único marcador. Este método examina el ADN en las células del colon exfoliadas para determinar metilación aberrante asociada al cáncer del gen de la vimentlna y alcanza un rango de sensibilidad de 72-77% y un rango de especificidad de 83-94% en individuos de riesgo medio.

Los ensayos de proteínas proporcionan un método alternativo para la detección de CCR. Se han descrito ensayos de evaluación de la presencia de enzimas derivadas de tumores tales como la piruvato quinasa M2 (M2-PK), y/o proteínas tales como calprotectlna, antfgeno carcinoembrionario (CEA), inhibidor tlsular de la metaloproteinasa-1 (TIMP-1) y proteína de unión a calcio S1 A12 (S1A12). Un diagnóstico de cáncer colorrectal utilizando una combinación de sangre oculta en materia fecal y los marcadores de proteínas fecales novedosos S1A12 y TIMP-1 se ha descrito... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal en una muestra fecal, que comprende:

(a) detectar la presencia de sangre en la muestra fecal, en donde la detección de la presencia de sangre es indicativa de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal; y

(b) detectar una modificación epigenética en el ADN contenido dentro de la muestra fecal, en donde la modificación epigenética es detectada en al menos un gen seleccionado entre NDRG4, PHACTR3, FOXE1, GATA4, GPNMB, TFPI2, SOX17, SYNE1, LAMA, MMP2, OSMR, SFRP2 y CD1 y en donde la detección de la modificación epigenética en al menos uno de los genes es indicativa de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal y sobre la base de un resultado positivo obtenido en (a) o (b) o tanto en (a) como en (b) detectar una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la detección de la presencia de sangre en la muestra fecal comprende la detección de la hemoglobina en la muestra fecal opcionalmente en donde la hemoglobina en la muestra fecal se detecta a través de medios inmunoquímicos.

3. El método de la reivindicación 2 en donde:

(i) el resultado en la etapa (a) se considera positivo si la concentración de hemoglobina detectada está al menos entre aproximadamente 5 a 15 ng/ml; o

(ii) en donde el resultado en la etapa (a) se considera positivo si la concentración de hemoglobina detectada es al menos aproximadamente 1 ng/ml.

4. Un método para detectar una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal en una muestra fecal que comprende:

(a) detectar la presencia de sangre en la muestra fecal, que comprende la detección de la hemoglobina en la muestra fecal opcionalmente en donde la hemoglobina en la muestra fecal se detecta a través de medios inmunoquímicos en donde la detección de la presencia de sangre es indicativa de una predisposición a, o la incidencia de, colorrectal cáncer; y

(b) detectar una modificación epigenética en el ADN contenido dentro de la muestra fecal, en donde la modificación epigenética se detecta en al menos un gen seleccionado entre NDRG4, PHACTR3, FOXE1, GATA4, GPNMB, TFPI2, SOX17, SYNE1, LAMA, MMP2, OSMR, SFRP2 y CD1 y en donde la detección de la modificación epigenética en al menos uno de los genes es indicativo de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal en donde:

(i) el resultado en la etapa (a) se considera positivo si la concentración de hemoglobina detectada es mayor que un nivel umbral predeterminado, cuyo nivel umbral es más bajo que el empleado típicamente como concentración umbral de hemoglobina en otras pruebas de detección de hemoglobina, pero para aquellas muestras en las que se detecta una menor concentración de hemoglobina, que se consideraría un resultado negativo en dichas otras pruebas, la etapa (b) se realiza solo sobre estas muestras y la detección de la modificación epigenética en la etapa (b) se utiliza en ese caso para confirmar el resultado positivo en la etapa (a); o

(ii) en donde el resultado en la etapa (a) se considera positivo si la concentración de hemoglobina detectada es al menos aproximadamente 1 ng/ml y en donde la etapa (b) se realiza solo en el caso de que la concentración de hemoglobina detectada esté entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 2 ng/ml y la detección de la modificación epigenética en la etapa (b) se utiliza en ese caso para confirmar el resultado positivo en la etapa (a).

5. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde la modificación epigenética se detecta en al menos un gen seleccionado entre PFIACTR3, NDRG4 y FOXE1, con detección de la modificación epigenética en al menos uno de los genes que proporcionan una indicación de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer de colon; opcionalmente en donde la modificación epigenética se detecta en un panel de al menos dos genes seleccionados entre PHACTR3, NDRG4 y FOXE1, con detección de la modificación epigenética en al menos uno de los genes que proporcionan una indicación de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal; opcionalmente en donde el panel de genes comprende, consiste esencialmente en o consiste en PFIACTR3, NDRG4 y FOXE1, NDRG4 y FOXE1, PHACTR3 y NDRG4 o PHACTR3 y FOXE1.

6. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde la modificación epigenética es la metilación.

7. El método de cualquier reivindicación precedente, que utiliza cebadores seleccionados entre cebadores que comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas en la Tabla 1, preferiblemente que utiliza cebadores seleccionados entre cebadores que comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas como SEC ID NO: 1 y 2 (PFIACTR3), 4 y 5 (FOXE1), y 7 y 8 (NDRG4) con el fin de detectar el estatus de metilación en el ADN y/o que utiliza sondas seleccionadas entre las sondas que comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas en la Tabla 1, preferiblemente que utiliza sondas seleccionadas entre las sondas que comprenden las secuencias de nucleótidos

expuesta como SEC ID NO: 3 (PHACTR3), 6 (FOXE1), y 9 (NDRG4) con el fin de detectar el estatus de metilación en el ADN y/o en donde una única muestra fecal se utiliza como la fuente de la muestra para (a) y (b) opcionalmente en donde la muestra fecal se divide para permitir que se lleven a cabo (a) y (b).

8. Un método de procesamiento de la muestra que comprende la eliminación de una porción de una muestra fecal recogida y la adición de la porción separada de la muestra a un tampón que impide la desnaturalización o degradación de proteínas de la sangre encontradas en la muestra, seguido de las etapas de detección (a) y (b) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende adlcionalmente:

(i) enviar o entregar de otro modo la porción restante de la muestra fecal recogida a un laboratorio para realizar la etapa (b) del método de la reivindicación 1, opcionalmente como se define adicionalmente en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, sobre la porción restante de la muestra fecal recogida; y/o

(ii) enviar o entregar de otro modo la porción separada de la muestra fecal recogida a un laboratorio para realizar la etapa (a) del método de la reivindicación 1, opcionalmente como se define adicionalmente en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, sobre la porción separada de la muestra; y/o

(iii) realizar la etapa (b) del método de la reivindicación 1, opcionalmente como se define adicionalmente en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, sobre la porción restante de la muestra fecal recogida; y/o

(iv) realizar la etapa (a) del método de la reivindicación 1, opcionalmente como se define adicionalmente en cualquiera de las reivindicaciones 2 o 4, sobre la porción separada de la muestra.

1. El método de cualquier reivindicación precedente en donde la muestra fecal utilizada para realizar la etapa (b) pesa no más de aproximadamente 4 gramos.

11. Un kit para la detección de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal en una muestra fecal que comprende la combinación de:

(a) medios para detectar la presencia de sangre en la muestra fecal, en donde la detección de la presencia de sangre es indicativa de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal; y

(b) cebadores y/o sondas que permitan determinar directamente el estatus de metilación de al menos un gen seleccionado entre NDRG4, PHACTR3, FOXE1, GATA4, GPNMB, TFPI2, SOX17, SYNE1, LAMA, MMP2, OSMR, SFRP2 y CD1 en el ADN, donde la detección del estatus de metilación es indicativo de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal.

12. El kit de la reivindicación 11, que comprende cebadores y/o sondas que permiten determinar directamente el estatus de metilación de al menos un gen seleccionado entre PHACTR3, NDRG4 y FOXE1.

13. El kit de la reivindicación 12, que comprende cebadores y/o sondas que permiten determinar directamente el estatus de metilación en un panel de al menos dos genes seleccionados entre PHACTR3, NDRG4 y FOXE1, proporcionando la detección de la modificación epigenética en al menos uno de los genes una indicación de una predisposición a, o la incidencia de, cáncer colorrectal.

14. El kit de la reivindicación 13, en donde los cebadores se seleccionan entre cebadores que comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas como SEC ID NO: 1 y 2 (PHACTR3), 4 y 5 (FOXE1), y 7 y 8 (NDRG4) y/o en donde las sondas se seleccionan entre sondas que comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas como SEC ID NO: 3 (PHACTR3), 6 (FOXE1), y 9 (NDRG4).

15. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el medio para detectar la presencia de sangre en la muestra fecal comprende medios para la detección de hemoglobina en la muestra fecal, opcionalmente en donde la hemoglobina en la muestra fecal se detecta a través de medios inmunoquímicos.