Método de análisis de plaquetas.

Un método para el análisis de plaquetas mediante la discriminación de las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados,

que comprende las etapas de:

preparar una muestra de medición mezclando una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, seleccionándose el colorante del grupo que consiste en azul Capri de fórmula (1), azul Nilo de fórmula (2) y azul cresil brillante de fórmula (3);

medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la muestra de medición mediante irradiación de las células con luz; y

detectar las plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia,**Fórmula**

en donde

la concentración del azul Capri en la muestra de medición es de 0,1 a 2,0 ppm;

la concentración del azul Nilo en la muestra de medición es de 0,05 a 2,0 ppm; y

la concentración del azul cresil brillante en la muestra de medición es de 0,5 a 5,0 ppm.

Método de análisis de plaquetas Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para el análisis de plaquetas. La presente invención también se refiere a un método para el análisis de plaquetas y reticulocitos.

2. Descripción de la técnica relacionada La sangre humana contiene varias células de la sangre tales como glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. Entre éstas, las plaquetas son células anucleadas de 2 a 3 μl de diámetro. En la sangre humana normal, hay de 150.000 a 350.000 plaquetas por microlitro.

Sin embargo, se sabe que el número de plaquetas en la sangre se reduce después de la afectación por trombocitopenia tal como púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) o con leucemia aguda. Por lo general, se considera que la transfusión de sangre es necesaria cuando el número de plaquetas en sangre es menor de 10.000 por μl. En consecuencia, la medición rápida y precisa del número de plaquetas es importante en el campo clínico.

Uno de los métodos conocidos de medición de plaquetas es un método de utilización de la resistencia eléctrica. Este método es un método que consiste en medir un pulso de impedancia eléctrica al pasar una muestra que contiene plaquetas entre 2 electrodos y analizarla en un histograma. En el método de utilización de la resistencia eléctrica, sin embargo, existe el problema de que no se puede lograr suficiente precisión de la medición dependiendo de una muestra.

En consecuencia, se conoce un método para medir el número de plaquetas mediante el uso de un anticuerpo específico marcado para el antígeno de superficie de las plaquetas (véase American Journal of Clinical Patologists (2001) :115, págs. 460-464) . Se sabe que el método descrito en esta publicación es un método altamente sensible, pero que el método generalmente requiere mucho tiempo hasta que se obtienen resultados debido a se utiliza en la medición una reacción antígeno-anticuerpo. En consecuencia, este método no es adecuado como método de medición de las plaquetas en el campo clínico que requiere, por ejemplo, el criterio urgente de si se requiere transfusión de sangre o no.

Los reticulocitos también se encuentran en la sangre. Los reticulocitos son glóbulos rojos jóvenes inmediatamente después de la liberación de células eritroblásticas enucleadas en la médula ósea a la sangre periférica. Los reticulocitos se caracterizan porque en el procedimiento de maduración de las células, están contenidos en forma de trazas en sus células una pequeña cantidad de ARN y orgánulos tales como mitocondrias y ribosomas, que no están contenidos en los glóbulos rojos maduros.

En el campo del examen clínico, la clasificación y el recuento de reticulocitos es muy importante para entender la hematopoyesis en la médula ósea en un paciente. En un sujeto saludable con mielopoyesis normal, reticulocitos representan de 0, 5 a 3, 0% de todos los glóbulos rojos de la sangre. Por otro lado, el número de reticulocitos se reduce en un estado anormal de mielopoyesis (por ejemplo, en un estado de supresión de mielopoyesis) o aumenta en un estado acelerado de mielopoyesis. En concreto, los reticulocitos disminuyen durante la anemia aplásica y la terapia química para el tumor maligno o aumentan en la anemia hemolítica etc.

Se conoce un método para medir rápidamente las células en la sangre (es decir, células de la sangre tales como glóbulos blancos, reticulocitos y glóbulos rojos) utilizando el principio de la citometría de flujo. En cuanto a tal método de medición, se describen un método de recuento e identificación de reticulocitos, glóbulos rojos y plaquetas en una muestra de sangre completa, así como una composición de reactivo para su uso en el método en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.114.173. En el método, una mezcla de reactivos que contiene un colorante catiónico (en particular, oxazina 750) se mezcla con una muestra que contiene reticulocitos. A continuación, se miden la luz dispersada y la luz absorbida de la mezcla resultante por medio de citometría de flujo. Mediante el uso de la luz dispersada y la luz absorbida como parámetros, se cuentan los reticulocitos y se distinguen de los glóbulos rojos y plaquetas.

La Patente de los Estados Unidos Núm. 4.882.284 describe un método para discriminar los glóbulos blancos de los glóbulos rojos y las plaquetas en la sangre completa no lisada. En el método, un reactivo que contiene un colorante fluorescente que absorbe luz roja se pone en contacto con sangre completa no lisada. Se describe allí que un colorante de oxazina utilizado como colorante fluorescente que absorbe luz roja tiñe glóbulos blancos, y por lo tanto los glóbulos blancos se pueden distinguir de los glóbulos rojos y las plaquetas mediante medición utilizando

citometría de flujo.

La Patente de los Estados Unidos Núm. 5.891.731describe un reactivo para la medición de reticulocitos, que comprende al menos un colorante que tiñe específicamente reticulocitos y un colorante que tiñe específicamente a 5 los glóbulos blancos. Esta patente también describe que un colorante con una base de oxazina puede teñir específicamente glóbulos blancos.

El documento US 4.336.029 describe métodos y composiciones para la cuantificación de reticulocitos y plaquetas mediante fluorescencia en un citómetro de flujo. Se describe una composición que comprende el colorante naranja 10 de acridina.

En la sangre puede aparecer fragmentación de glóbulos rojos, lípidos y similares. En la medición de las plaquetas, los glóbulos rojos, lípidos y similares fragmentados tienen un tamaño similar a las plaquetas y por lo tanto se conocen como contaminantes que incluyen en la medición. La influencia de estos contaminantes es significativa en particular en la medición de una muestra en la que el número de plaquetas es tan bajo que es necesaria la transfusión de sangre. Sin embargo, las publicaciones mencionadas más arriba no describen que las plaquetas se miden con mayor precisión mediante la supresión de la influencia de tales contaminantes.

A partir de lo anterior, existe una demanda de técnicas capaces de medir plaquetas distinguiéndolas más claramente 20 de otras células de la sangre y contaminantes de la sangre, tales como partículas lipídicas.

Compendio de la invención El alcance de la presente invención está definido únicamente por las reivindicaciones adjuntas, y no se ve afectado 25 en ningún grado por las declaraciones dentro de este compendio.

La presente invención proporciona un método capaz de analizar las plaquetas al discriminarlas más claramente de otras células de la sangre y contaminantes en la sangre, tales como partículas lipídicas en un método de análisis mediante citometría de flujo.

La presente invención proporciona un método para el análisis de las plaquetas al discriminar las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, que comprende las etapas de: preparar una muestra de medición mediante la mezcla de una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, seleccionándose el colorante del grupo que consiste en azul Capri, azul Nilo y azul cresil brillante; medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la muestra de medición irradiando las células con luz; y detectar las plaquetas sobre la base de la luz dispersada y la fluorescencia, en donde la concentración de azul Capri en la muestra de medición es de 0, 1 a 2, 0 ppm; la concentración del azul de Nilo en la muestra de medición es de 0, 05 a 2, 0 ppm; y la concentración del azul cresil brillante en la muestra de medición es de 0, 5 a 5, 0 ppm.

Descripción de los dibujos Las Figs. 1A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando un reactivo que contiene un colorante de oxazina diferente. La Fig. 2 muestra diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el

análisis de plaquetas con diferentes concentraciones de Capri azul. Las Figs. 3A y B muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo de medición de plaquetas con diferentes concentraciones de azul Nilo. Las Figs. 4A y B muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando cada reactivo para el análisis de plaquetas con diferentes concentraciones de azul cresil brillante.

Las Figs. 5A y B muestran gráficos que muestran la correlación entre el número de plaquetas determinado por medio del método en una realización de la invención y el número de plaquetas determinado por medio de un método convencional. Las Figs. 6A a C muestran diagramas de dispersión obtenidos mediante medición utilizando... [Seguir leyendo]

1. Un método para el análisis de plaquetas mediante la discriminación de las plaquetas de los glóbulos rojos fragmentados, que comprende las etapas de:

preparar una muestra de medición mezclando una muestra y un colorante para la tinción de plaquetas, seleccionándose el colorante del grupo que consiste en azul Capri de fórmula (1) , azul Nilo de fórmula (2) y azul cresil brillante de fórmula (3) ; medir la luz dispersada y la fluorescencia emitida a partir de células en la muestra de medición mediante irradiación de las células con luz; y

detectar las plaquetas basándose en la luz dispersada y la fluorescencia,

en donde la concentración del azul Capri en la muestra de medición es de 0, 1 a 2, 0 ppm;

la concentración del azul Nilo en la muestra de medición es de 0, 05 a 2, 0 ppm; y la concentración del azul cresil brillante en la muestra de medición es de 0, 5 a 5, 0 ppm.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa de preparación comprende mezclar el primer

colorante para la tinción de plaquetas, la muestra y un segundo colorante para tinción de reticulocitos para preparar la muestra de medición, y la etapa de detección comprende la detección de plaquetas y reticulocitos en base a la luz dispersada medida y a la fluorescencia medida.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la muestra de medición se introduce en una celda de flujo de un citómetro de flujo, y las células de la muestra de medición que fluyen en la celda de flujo se irradian con luz.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente una etapa de recuento de las plaquetas detectadas. 15

5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una etapa de recuento de las plaquetas detectadas y una etapa de recuento de reticulocitos detectados.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el segundo colorante es un colorante de cianina capaz de 20 teñir un ácido nucleico.