Procedimiento de medición de la activación del complemento mediante IgG.

Procedimiento de medición de la activación del complemento mediante inmunoglobulinas G,

que comprende las siguientes etapas:

a) preparación de una muestra A de inmunoglobulinas G (IgG), y de una muestra B que comprende suero nativo, diluyéndose dicho suero nativo eventualmente en una solución tampón;

b) mezcla de la muestra A con la muestra B en una proporción "cantidad de IgG en A, en gramos" : "volumen de suero nativo en B, en litros" comprendida entre 30 y 75, a una temperatura comprendida entre 2 ºC y 6 ºC, y a continuación incubación de la mezcla reactiva obtenida a una temperatura comprendida entre 35 ºC y 40 ºC durante un tiempo comprendido entre 30 minutos y 2 horas;

c) enfriamiento de la mezcla reactiva obtenida al final de la etapa b) a una temperatura comprendida entre 0 ºC y 4 ºC, y en presencia de EDTA;

d) medición de la cantidad de fragmento C5a en la mezcla reactiva enfriada obtenida en c).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2011/051012.

Solicitante: LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: ZONE D'ACTIVITÉ DE COURTABOEUF, 3, AVENUE DES TROPIQUES 91940 LES ULIS FRANCIA.

Inventor/es: DHAINAUT, FREDERIC, PERRET,Gérald.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N33/564 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para complejos inmunológicos preexistentes o enfermedades autoinmunes.
  • G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

PDF original: ES-2546983_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento de medición de la activación del complemento mediante IgG Sector de la técnica

La invención se refiere a un procedimiento de medición de la activación del complemento mediante inmunoglobulinas G (IgG), en particular inmunoglobulinas G intravenosas humanas (IVIG). El procedimiento permite seleccionar las IVIG en función de su efecto sobre el complemento.

Estado de la técnica

Las IVIG son un concentrado de inmunoglobulinas G no agregadas preparadas a partir de una mezcla de plasma humano. Su función está intacta, y su pureza es la más alta posible (> 99,9 %).

Las IVIG modulan, mediante unos mecanismos moleculares selectivos y a menudo distintos, ciertos procesos biológicos implicados en la respuesta inmune innata o adquirida. Estos últimos incluyen:

- un bloqueo funcional de los receptores Fe del sistema reticulo-endotelial. Esto permite en particular tratar las citopenias auto-inmunes periféricas, como la púrpura trombocitopénica idiopática;

- la neutralización de auto-anticuerpos y la inhibición de su producción. Las IVIG contienen en efecto anticuerpos anti-idiotfpicos. Dicha actividad neutralizante o inhibidora se ha demostrado por ejemplo para los auto- anticuerpos contra el factor VIII, el ADN, el factor intrínseco, la tiroglobulina y los ANCA (Antl-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies);

- la modulación de la producción de citocinas (entre las que están la IL-1, -2, -3, -4, -5, -10, la TNF-a y el GM-CSF) y de sus antagonistas (como la IL-1 RA), de lo que resulta una actividad antl-lnflamatorla;

- la activación del complemento;

- o incluso la activación o el bloqueo funcional del receptor de muerte celular Fas (CD95).

Floy en día, la administración de IVIG se ha convertido en un gesto terapéutico que conlleva muy pocos riesgos o efectos secundarios (< 1 %). Estos últimos son leves gracias a la mejora constante de la calidad de estos productos.

La mayor parte de los efectos secundarios de carácter leve y transitorio se producen en la primera hora de perfusión; comprenden mlalgias, cefaleas, sofocos, sensación de opresión, dorsalgias, náuseas, vómitos, broncoespamos, o incluso alteraciones del pulso y/o de la tensión arterial. Son probablemente la consecuencia de una cierta agregación de las inmunoglobulinas, de la formación de complejos antígeno-anticuerpo y la activación del complemento, o de azúcares presentes en las IVIG con el objetivo de prevenir su agregación. Estos efectos secundarios se controlan por lo general reduciendo la velocidad de perfusión o administrando rápidamente esteroides o antihistamínicos e incluso simpaticomiméticos.

Sin embargo, en determinados casos puede producirse una insuficiencia renal aguda y/o una anemia hemolítica. En casos extremos, puede producirse una reacción anafiláctica, y esto en particular en pacientes que tienen una deficiencia de IgA séricas.

Por lo tanto, la disminución de los efectos secundarios de las IVIG, aunque estos sean leves, sigue siendo la preocupación principal en el desarrollo de estas moléculas.

Diferentes métodos están actualmente disponibles para evaluar estos efectos secundarios, por ejemplo la prueba de AAC (actividad anticomplementaria) de la farmacopea europea, también llamado ensayo de actividad anticomplementaria de la inmunoglobulina; o incluso la prueba de Coombs. La prueba de AAC es compleja y hace que Intervengan reactivos difíciles de normalizar. En efecto, la determinación de la actividad anticomplementaria (AAC) de la inmunoglobulina se realiza mediante incubación de una cantidad dada de la Inmunoglobulina que hay que examinar con una cantidad dada de complemento de cobaya seguida de la valoración del complemento restante. El complemento restante se mide mediante la llsls de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos de conejo.

En cuanto a la prueba de Coombs, permite verificar la ausencia de Inmunoglobulina que se pueda fijar en los hematíes y que pueda provocar la aglutinación y la llsls de los hematíes.

SPYCHER M. y otros: "In vitro comparison of the complement-scavenglng capaclty of different intravenous ¡mmunoglobulin preparations", VOX SANGUINIS, vol. 97, n°. 4, 2009, págs. 348-354, describe la comparación de las propiedades de captura del complemento por diferentes IVIG. Esta comparación se realiza de acuerdo con varios protocolos, concerniendo a la captura de C3b/IC3b por las IVIG, al enlace del C3b activado con las IVIG y a la generación de C5a por las IVIG.

Existe, por lo tanto, la necesidad de disponer de pruebas lo suficientemente sensibles para seleccionar diferentes

calidades de IVIG, que sean fáciles de implementar para una utilización rutinaria. También existe la necesidad de disponer de pruebas pertinentes y predictivas para el ser humano. Estas pruebas deben, en particular, demostrar una buena calidad y una seguridad suficiente de las IVIG para el paciente.

Es la razón por la que la solicitante se ha centrado en el desarrollo de un nuevo procedimiento in vitro que permita evaluar la acción de las IgG, en particular de las IVIG, sobre la activación del complemento. Este procedimiento permite seleccionar fácilmente las IgG que tienen el menor número de efectos secundarios posible, y esto con una sensibilidad suficiente para discriminar diferentes calidades de IgG. Este procedimiento utiliza suero humano y es, por consiguiente, predictivo del resultado en el ser humano.

Objeto de la invención

La presente invención tiene, por lo tanto, por objeto un procedimiento de medición de la activación del complemento mediante unas inmunoglobulinas G, que comprende las siguientes etapas:

a) preparación de una muestra A de inmunoglobulinas G (IgG), y de una muestra B que comprende suero nativo, diluyéndose dicho suero nativo eventualmente en una disolución tampón;

b) mezcla de la muestra A con la muestra B en una proporción (cantidad de IgG en A, en gramos): (volumen de suero nativo en B, en litros) comprendida entre 30 y 75, a una temperatura comprendida entre 2 °C y 6 °C, ya continuación incubación de la mezcla reactiva obtenida a una temperatura comprendida entre 35 °C y 40 °C durante un tiempo comprendido entre 30 minutos y 2 horas;

c) enfriamiento de la mezcla reactiva obtenida al final de la etapa b) a una temperatura comprendida entre 0 °C y 4 °C, y en presencia de EDTA;

d) medición de la cantidad de fragmento C5a en la mezcla reactiva enfriada obtenida en c).

Por supuesto, el procedimiento de acuerdo con la invención es un procedimiento in vitro.

Este procedimiento mide la activación del complemento mediante unas IgG, de preferencia unas IgG humanas, de preferencia unas IVIG. También de preferencia, la muestra A es una muestra de IVIG.

La etapa a) del procedimiento de acuerdo con la invención comprende la preparación de una muestra A de IgG. Esta muestra A se puede obtener en particular a partir de IVIG comerciales, como Privigen de CSL Behring AG, Gamunex de Bayer Corporation, Intratect de Biottest Pharma GmbH, Kiovig de Baxter AG o Octagam dOctapharma. La preparación puede estar en forma líquida o liofilizada, como Sandoglobulin de CSL Behring AG.

La muestra A también se puede obtener a partir de IVIG no comerciales, como nuevas IVIG (IgNG).

Las IgG, de preferencia IVIG, se pueden diluir en un medio tampón utilizado tradicionalmente, como el tampón fosfato salino/suero de albúmina bovina (p. ej. PBS-BSA). De preferencia, las IgG, en particular las IVIG, se diluyen un tampón que comprende BSA.

La etapa a) también comprende la preparación de una muestra B que comprende suero nativo.

Por suero, se entiende el plasma sanguíneo sin fibrina. Por "suero nativo" se entiende un suero no diluido. El suero nativo es, de preferencia, suero humano nativo. El suero nativo de la muestra B puede proceder de diferentes donantes, con diferentes grupos sanguíneos. De preferencia, el suero nativo es un suero humano de grupo sanguíneo AB+.

De preferencia, el suero nativo se conserva congelado hasta su utilización, por ejemplo a una temperatura de -80 °C. Durante la utilización, se va descongelando lentamente hasta la temperatura de mezcla.

La muestra B puede contener únicamente suero nativo; como alternativa, la muestra B comprende suero nativo diluido en una solución tampón.

Dicha solución tampón es clásica y se puede seleccionar entre el tampón fosfato salino (PBS) y el PBS-BSA.

De preferencia, la solución tampón comprende BSA; de preferencia la solución tampón es el PBS-BSA.

De preferencia, la muestra A comprende unas IgG diluidas en un tampón idéntico a la solución tampón de la muestra B.

Una vez preparadas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de medición de la activación del complemento mediante inmunoglobulinas G, que comprende las siguientes etapas:

a) preparación de una muestra A de inmunoglobulinas G (IgG), y de una muestra B que comprende suero nativo, diluyéndose dicho suero nativo eventualmente en una solución tampón;

b) mezcla de la muestra A con la muestra B en una proporción "cantidad de IgG en A, en gramos": "volumen de suero nativo en B, en litros" comprendida entre 30 y 75, a una temperatura comprendida entre 2 °C y 6 °C, y a continuación incubación de la mezcla reactiva obtenida a una temperatura comprendida entre 35 °C y 40 °C durante un tiempo comprendido entre 30 minutos y 2 horas;

c) enfriamiento de la mezcla reactiva obtenida al final de la etapa b) a una temperatura comprendida entre 0 °C y 4 °C, y en presencia de EDTA;

d) medición de la cantidad de fragmento C5a en la mezcla reactiva enfriada obtenida en c).

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la proporción "cantidad de IgG en A, en gramos": "volumen de suero nativo en B, en litros" de la etapa b) está comprendida entre 35 y 70.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que la proporción "cantidad de IgG en A, en gramos": "volumen de suero nativo en B, en litros" de la etapa b) está comprendida entre 40 y 65.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque la proporción "cantidad de IgG en A, en gramos": "volumen de suero nativo en B, en litros" de la etapa b) está comprendida entre 45 y 60.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la incubación de la etapa b) se hace a una temperatura de aproximadamente 37 °C, durante un tiempo comprendido entre 45 minutos y 1 hora.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el EDTA se utiliza en la etapa c) en una concentración comprendida entre 50 mM y 200 mM.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que el EDTA se utiliza en la etapa c) en una concentración de aproximadamente 100 mM.

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la muestra A es una muestra de IVIG.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que el suero nativo de la muestra B es un suero humano de grupo sanguíneo AB+.

10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende una etapa e) de comparación de la cantidad obtenida en d) con la cantidad obtenida al sustituir la muestra A por unos lipopolisacáridos (LPS) de E. Coli de serotipo 0127:B8 purificados mediante la extracción con fenol.

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que comprende una etapa e) de medición del porcentaje de activación del complemento, obtenida mediante la siguiente fórmula:

[prueba - control negativo] / [activación máxima del complemento - control negativo] * 100 en la que:

"prueba" es la cantidad de fragmento C5a medida en la mezcla reactiva probada;

"control negativo" es la cantidad de fragmento C5a medida en la mezcla reactiva en la que se ha sustituido la muestra A por la disolución tampón;

"activación máxima del complemento" es la cantidad de fragmento C5a medida en la mezcla reactiva en la que se sustituye la muestra A por unos lipopolisacáridos (LPS) de E. Coli de serotipo 0127:B8 purificados mediante la extracción con fenol.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque la proporción "cantidad de LPS, en gramos": "volumen de suero nativo en B, en litros" está comprendida entre 6 y 15.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que la proporción "cantidad de LPS, en gramos": "volumen de suero nativo en B, en litros" está comprendida entre 7 y 14.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 o 13, caracterizado por que la proporción "cantidad de LPS, en gramos": "volumen de suero nativo en B, en litros" está comprendida entre 8 y 13.

15. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que la etapa d) de medición de la cantidad de fragmento C5a se realiza mediante una prueba ELISA.


 

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