Lipopéptidos de alta pureza, micelas de lipopéptidos y procesos para preparar los mismos.

Un método para purificar daptomicina que comprende:

a) someter a la daptomicina a condiciones en las que la solución micelar de daptomicina se forma alterando el pH;

b) separar las micelas de daptomicina en la solución micelar de daptomicina de los contaminantes de bajo peso molecular por una técnica de separación por tamaño;

c) someter a la daptomicina a condiciones en las que una solución monomérica de daptomicina se forma alterando el pH; y

d) separar las moléculas de daptomicina monoméricas en la solución monomérica de daptomicina de las moléculas o agregados de alto peso molecular por una técnica de separación por tamaño.

Lipopéptidos de alta pureza, micelas de lipopéptidos y procesos para preparar los mismos CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCiÓN

La presente divulgación se refiere a una fonna altamente purificada de lipopéptidos, incluyendo daptomicina. un antibiótico de lipopéplidos con actividad bactericida potente contra bacterias gram positivas, incluyendo cepas que son resistentes a antibióticos convencionales. La presente invención se refiere a un proceso para preparar la forma altamente purificada de la daptomicina de lipopéptidos. La presente divulgación se refiere además a micelas de lipopéptidos. La presente divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas de las micelas de lipopéplidos y métodos para usar estas composiciones. La presente invención también se refiere a métodos de hacer micelas de daptomicina a partir de monómeros no asociados de daptomicina, y para convertir micelas de daptomicina a monómeros no asociados. La presente invención también se refiere a un proceso para preparar daptomicina usando micelas que es fácilmente ajustado a escala para la producción comercial.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

El rápido aumento en la incidencia de infecciones provocadas por bacterias gram-positivas, incluyendo aquellas provocadas por bacterias resistentes a los antibióticos, ha suscitado intereses renovados en el desarrollo de novedosas clases de antibióticos. Una clase de este tipo son los antibióticos lipopeptídicos, que incluye la daptomicina. La daptomicina tiene una potente actividad bactericida in vitro frente a bacterias gram-positivas clínicamente relevantes que provocan enfermedades graves y potencialmente mortales. Estas bacterias incluyen patógenos resistentes, tales como enterococos resistentes a la vancomicina (ERV) , Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) , Staphylococcus aureus de sensibilidad intermedia a glicopéptidos (SAIG) , estafilococos coagulasa negativos (ECN) y Streptococcus pneumoniae resistente a penicilina (SPRP) , para los que existen muy pocas alternativas terapéuticas. Véase, por ejemplo, Tally et al. , 1999, Exp. Opino Invesl. Drugs 8:1223-1238, en lo sucesivo "Tally". El efecto inhibidor de la daptomicina es un efecto rápido, bactericida dependiente de la concentración in vitro e in vivo, y un efecto después del antibiótico dependiente de la concentración relativamente prolongado in vivo.

Baltz describe la daptomicina en Biotechnology of Antibiotics, 2~ Ed., editor W.R. Strohl (Nueva York: Marcel Dekker, Inc.) , 1997, págs. 415-435, en lo sucesivo en el presente documento "Baltz". La daptomicina, también conocida como LY 146032, es un antibiótico lipopeptidico cíclico que puede derivarse de la fermentación de Streptomyces roseosporus. La daptomicina es un miembro de los antibióticos de tipo factor A-21978Co de S. roseosporus y está compuesta por una cadena lateral de decanoUo unida al triptátano N-terminal de un péptido ciclico de 13 aminoácidos (figura 1) . La daptomicina tiene un excelente perfil de actividad porque es sumamente eficaz frente a la mayoría de bacterias grampositivas; es sumamente bactericida y de acción rápida; tiene una baja tasa de resistencia y es eficaz frente a los organismos resistentes a los antibióticos. En la actualidad, el compuesto está desarrollándose en una variedad de formulaciones para tratar infecciones graves provocadas por bacterias, incluyendo, pero sin limitarse a, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) y enterococos resistentes a vancomicina (ERV) .

Varias patentes estadounidenses describen los antibióticos A-21978C y derivados de los mismos, incluyendo daptomicina (LY 146032) asi como métodos de producción y aislamiento de los antibióticos A-21978C y derivados de los mismos.

Las patentes estadounidenses de nuevo examen 32.333, de nuevo examen 32.455 y 4.800.157 describen un método de sintesis de daptomicina cultivando Streptomyces roseosporus NRL15998 en condiciones de fermentación aerobia sumergida. La patente estadounidense 4.885.243 describe un método mejorado de sintesis de daptomicina alimentando a un cultivo de fermentación un ácido graso decanoico o éster o sal del mismo.

Las patentes estadounidenses de nuevo examen 32.310, de nuevo examen 32.311 , 4.537.717,

4.482.487 Y 4.524.135 describen métodos de desacilación del antibiótico A-21978C y reacilación del núcleo peptidico y derivados antibióticos preparados mediante este procedimiento. Todas estas patentes describen un núcleo de antibiótico A-21978C desacilado purificado o un derivado del mismo que se aisló del caldo de fermentación mediante filtración y, luego, se purificó mediante cromatografía en Diaion HP-20 y cromatografia en gel de sílicefC18.

Las patentes estadounidenses de nuevo examen 32.333 y de nuevo examen 32.455 dan a conocer un método de purificación en el que un filtrado de todo el caldo de fermentación se pUrificó a través de varias etapas de precipitación y de extracción para obtener un complejo crudo de A-21978C. El complejo crudo se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico en IRA-68 y dos series de cromatografia en gel de silice. Los faclores A-21978C individuales se separaron mediante gel

de sílice en fase inversa o gel de sílicefC18. Las patentes estadounidenses de nuevo examen 32.333 y de nuevo examen 32.455 también dan a conocer que puede purificarse A-21978C mediante cromatografía discontinua usando resina de Oiaion HP-20 seguida de cromatografía en columna de gel de sílice.

La patente estadounidense 4.874.843 describe un método de purificación de daptomicina en el que se filtró el caldo de fermentación y se hizo pasar a través de una columna que contenía resina HP-20. Tras la elusión, la daptomicina semipurificada se hizo pasar a través de una columna que contenía HP20ss, y después se separó de nuevo en resina HP-20. La patente '843 afirma que la resolución final y la separación de daptomicina de compuestos estructuralmente similares mediante este método se ven impedidas por la presencia de impurezas que no pueden identificarse mediante análisis por ultravioleta del caldo de fermentación. La patente '843 afirma también que los intentos por retirar estas impurezas mediante cromatografía en fase ínversa sobre gel de sílice, cromatografía en fase normal sobre gel de sílice o cromatografía de intercambio iónico también fallaron en mejorar significativamente la pureza de la daptomicina. La patente ·843 también da a conocer un ~método inverso" para la purificación, que comprende las etapas de poner en contacto una disolución acuosa del producto de fermentación con una resina no funcionalizada en fase acuosa, eliminar físicamente el agua de la resina cargada, rehumectar la resina cargada con un disolvente orgánico polar, lavar la resina con el disolvente orgánico, eluir el producto de fermentación de la resina aumentando la polaridad del disolvente y recuperar el producto de fermentación. La patente '843 enseña que este método mejora la pureza final desde aproximadamente el 80% hasta aproximadamente el 93% y aumenta el rendimiento desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 35%; sin embargo, la patente ·843 no da a conocer el tipo de impurezas presentes en la preparación de daptomicina .

La patente estadounidense 5.912.226 describe la identificación y el aislamiento de dos impurezas producidas durante la fabricación de daptomicina. La daptomicina, un péptido de D-aspartilo, se transpeptida para formar un producto intermedio estable en el que el grupo aspartilo pasa a ser un grupo anh idro-succinimido (figu ra 2) . La patente '226 enseña que la presencia de este producto intermedio, denominado anhidro-daptomicina, es más pronunciada a pH 4-6. La rehidratación de la forma de anhidro-succinimido produce un segundo producto de degradación que contiene un grupo ~-aspartilo y se denomina la forma de isómero ~ de daptomicina (figura 3) .

La patente '226 da a conocer que el derivado t-BOC de anhidro-daptomicina puede aislarse mediante cromatografía sobre columna de gel de sílicefC18 en fase inversa, precipitarse y volver a purificarse mediante cromatografia en gel de silicefC18 en fase inversa. La patente '226 también enseña que la forma de isómero ~ de daptomicina puede pUrificarse mediante cromatografia sobre una resina Oiaion HP-20ss, desalarse mediante cromatografía sobre una resina Oiaion HP-20 y purificarse adicionalmente usando una columna C-18 en fase inversa seguida de una columna con resina HP-20 en modo inverso.

Kirsch el al. (Pharmaceutical Research, 6:387-393, 1989, en lo sucesivo en el presente documento ~Kirsch") afirmaron que se produjeron anhidro-daptomicina yel isómero ~ en la purificación de daptomicina. Kirsch describió métodos... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificardaptomicina que comprende:

a) someter a la daptomicina a condiciones en las que la solución micelar de daptomicina se forma allerando el pH; b) separar las micelas de daptomicina en la solución micelar de daptomicina de los contaminantes de bajo peso molecular por una técnica de separación por tamaFio; cl someter a la daptomicina a condiciones en las que una solución monomérica de daptomicina se forma alterando el pH; y d) separar las moléculas de daptomicina monoméricas en la solución monomérica de daptomicina de las moléculas o agregados de alto peso molecular por una técnica de separación por tamaño 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1. en el que la técnica de separación por tamaño es 15 ullrafiltración o cromatografia de exclusión por tamaño.