Procedimiento para la preparación mediante filtración de una solución de factor VIII víricamente segura.

Procedimiento para la preparación mediante filtración de una solución de factor VIII víricamente segura,

según el cual: - se prepara una solución que comprende un complejo proteico de factor VIII-vWF; - se realiza una etapa que permite la disociación de los complejos de factor VIII-vWF de alto peso molecular, por medio de un ión caotrópico en cantidad suficiente para permitir la disociación; - se realiza una etapa de filtración de dicha solución sobre un filtro hidrófilo con una porosidad de 15 nm como máximo.

Procedimiento para la preparación mediante filtración de una solución de factor VIII víricamente segura.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación mediante filtración de una solución de factor VIII víricamente segura y esencialmente desprovista de factor von Willebrand (vWF) de alto peso molecular, a partir de una solución de factor VIII de alta o muy alta pureza y que contiene unos complejos de factor VIII-vWF de alto peso molecular.

El factor VIII es un componente proteico de la sangre utilizado desde hace muchos años para el tratamiento de individuos que sufren de hemofilia A, una enfermedad congénita causada por una deficiencia o ausencia de factor VIII en la sangre. Se han utilizado durante mucho tiempo unos concentrados plasmáticos enriquecidos con factor VIII, para el tratamiento de los pacientes.

Los concentrados utilizados más corrientemente eran el crioprecipitado y los concentrados purificados obtenidos a partir del crioprecipitado. Se denomina habitualmente crioprecipitado a un precipitado obtenido a partir de un plasma humano congelado, mediante una técnica de fraccionamiento plasmático a baja temperatura. El plasma congelado se reblandece a una temperatura de aproximadamente -5ºC a -15ºC, y después se calienta lentamente bajo agitación a una temperatura que no supera los 3ºC. En estas condiciones, el plasma congelado se funde parcialmente para dar una fase líquida y una fase sólida, siendo entonces la fase sólida recuperada mediante centrifugación para dar el crioprecipitado, que conviene entonces purificar para obtener preparaciones de factor VIII lo suficientemente puras. Esta fracción crioprecipitada se compone esencialmente de fibrinógeno, fibronectina, factor VIII y factor von Willebrand (vWF) .

En esta fracción crioprecipitada, el factor VIII está generalmente asociado al vWF que estabiliza el factor VIII mediante complejación.

Durante mucho tiempo, las etapas de purificación pretendían esencialmente separar del factor VIII proteínas indeseables tales como el fibrinógeno y la fibronectina.

Sin embargo, se sabe ahora que uno de los problemas esenciales relacionado con la preparación del factor VIII a partir del plasma reside en la necesidad de desactivar/eliminar virus originalmente contenidos en la sangre, con rendimientos satisfactorios.

Aunque es difícil establecer una lista exhaustiva de estos virus, se pueden citar en particular los diferentes virus hepáticos, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis G o también las diferentes formas del virus del SIDA (VIH) .

Así, se han desarrollado numerosas técnicas de desactivación vírica tal como el calentamiento hasta sequedad, la pasteurización, el tratamiento disolvente-detergente. El conjunto de estas técnicas es relativamente eficaz frente a virus encapsulados, pero la desactivación o la eliminación de los virus no encapsulados, especialmente de los virus pequeños tales como el parvovirus B19 o el virus de la hepatitis A, sigue siendo uno de los principales problemas.

Las tecnologías más recientes utilizan las capacidades de retención vírica de membranas de tamaño pequeño de poros. Estas tecnologías presentan efectivamente una eficacia notable frente a virus de pequeño tamaño, tales como los parvovirus B19 o el virus de la hepatitis A, y se pueden aplicar a proteínas de bajo peso molecular. Sin embargo, los niveles de corte utilizados, menores que 900 kD, no permiten considerar la filtración de proteínas o de complejos proteicos de alto peso molecular, como el factor VIII, sin grandes perdidas de rendimiento.

Así, por ejemplo, la publicación de la patente WO96/00237 describe un método para mejorar el poder filtrante de las proteínas en una solución que contiene al menos una macromolécula, que consiste en utilizar una solución en la que el contenido total de sal varía de 0, 2 M hasta saturación de la solución con la sal a la que se refiere. En Josic et al., J. Chromatogr. B. Biomed. Appl., Vol. 662, nº 2, 1994, se describe la utilización de Ca2+ para separar el factor VIII del factor vWF. Este contenido elevado de sal tiene por efecto aumentar los rendimientos de la filtración. Preferentemente, la etapa de filtración se utiliza en una fase en la que la actividad específica de la macromolécula de interés ya es muy elevada, de manera que sea posible utilizar un filtro con estructura muy fina y eliminar virus muy pequeños.

Sin embargo, este documento no prevé de ninguna manera la filtración de soluciones que contienen moléculas de muy alto peso molecular, tales como el factor VIII, y especialmente el factor VIII de origen plasmático, el cual está generalmente asociado con un vWF, formando así complejos de alto peso molecular. Este documento cita el ejemplo de una forma del factor VIII recombinante suprimida, con un peso molecular medio del orden de 170 kD, y totalmente desprovista de vWF. Todos los ejemplos hacen referencia al factor IX cuyo peso molecular medio es del orden de 55 kD, y este documento subraya que el método descrito es particularmente adecuado para este tamaño de molécula, debiendo ser además el nivel de corte del filtro ligeramente más elevado que el tamaño de la molécula a filtrar. Así, para el factor IX, el filtro utilizado tiene un nivel de corte de 70 kD.

Sin embargo, como se indica anteriormente, el factor VIII, según su origen, se puede presentar en forma complejada que le da un tamaño significativo, el cual puede alcanzar 20.000 kD en términos de peso molecular, y varias decenas de nanómetros en término de tamaño de partículas (>106 nm para el eje principal de la molécula, Eppel et al., Langmuir 1993, 9, 2281-88, American Chemical Society) . Hoy en día no hay ningún medio disponible para filtrar de manera satisfactoria este tipo de moléculas, y simultáneamente eliminar virus de pequeño tamaño, tales como, por ejemplo, los parvovirus B19, que tienen un tamaño del orden de 18 a 20 nm.

Se ha encontrado ahora, de manera sorprendente, que es posible obtener mediante filtración una solución de factor VIII víricamente segura y esencialmente desprovista de vWF de alto peso molecular, a partir de una solución que contiene un factor VIII de alta o muy alta pureza que contiene complejos de factor VIII-vWF de alto peso molecular.

Es por ello que la invención tiene por objeto un procedimiento para la preparación, mediante filtración, de una solución de factor VIII víricamente segura, según el cual:

- se prepara una solución que contiene un factor VIII de alta o muy alta pureza que contiene complejo de factor VIII-vWF;

- se realiza una etapa a) que permite la disociación de los complejos de factor VIII-vWF de alto peso molecular, mediante un ion caotrópico en cantidad suficiente para permitir la disociación, y la obtención de una solución esencialmente desprovista de factor VIII asociado con vWF de alto peso molecular;

- se realiza una etapa b) de filtración de dicha solución sobre un filtro hidrófilo que tiene una porosidad de 15 nm.

La preparación mediante filtración de una solución de FVIII permite obtener ventajosamente una solución esencialmente desprovista de vWF de alto peso molecular, especialmente de vWF que tiene un grado de polimerización mayor o igual que 15, es decir, en la que el vWF se controla cualitativa y cuantitativamente. El procedimiento según la invención permite igualmente aumentar significativamente los rendimientos de filtración gracias a la disminución de la cantidad de complejos proteicos de alto peso molecular, y permite obtener una solución que tiene un grado de pureza satisfactorio asegurando al mismo tiempo la eliminación vírica de los virus patógenos humanos de tamaño 15 nm.

La disociación del complejo FVIII-vWF se obtiene por medio de al menos un ión caotrópico, presente en cantidad suficiente para permitir la disociación. Se pueden utilizar cualesquiera iones conocidos que tengan una actividad caotrópica.

Preferentemente, se trata de iones divalentes aportados a la solución de factor VIII en forma de una solución salina de 0, 2 M hasta saturación de las sales.

Se puede citar a título de ejemplo no limitativo, CaCl2, o también MgCl2. Se utilizará preferentemente una solución de CaCl2. La concentración de la solución será preferentemente de aproximadamente 0, 35 M.

Se ha constatado que, además de las condiciones propias de la filtración, las condiciones utilizadas para la disociación tienen una influencia sobre el rendimiento de la filtración ulterior. Los parámetros que definen el conjunto de estas condiciones son, durante la etapa de disociación, la naturaleza de las sales y sus concentraciones, y, durante la etapa de filtración,...

1. Procedimiento para la preparación mediante filtración de una solución de factor VIII víricamente segura y esencialmente desprovista de vWF de alto peso molecular, según el cual:

- se prepara una solución de alta o muy alta pureza que comprende complejo proteico de factor VIII-vWF;

- se realiza una etapa que permite la disociación de los complejos de factor VIII-vWF de alto peso molecular, por medio de un ión caotrópico en cantidad suficiente para permitir la disociación, y la obtención de una solución esencialmente desprovista de factor VIII asociado a vWF de alto peso molecular, -se realiza una etapa de filtración de dicha solución sobre un filtro hidrófilo que tiene una porosidad de 15 nm.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho ión caotrópico es un ión divalente.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho ión divalente es el ión Ca2+ .

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho ión divalente se añade en forma de una solución salina de 0, 2 M hasta saturación de las sales.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha solución es una solución de CaCl2.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado porque dicho ión Ca2+ se añade en forma de una solución de CaCl2, 0, 35 M hasta saturación.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho filtro es una membrana Planova® 15 N utilizada con una presión inferior a 0, 3 bares, preferentemente inferior a 0, 2 bares.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la etapa de filtración se efectúa a una temperatura del orden de 35 ± 5 ºC.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la solución de partida se obtiene mediante purificación de una fracción plasmática, especialmente de la fracción crioprecipitada del plasma, mediante cromatografía de intercambio iónico.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la fracción concentrada de factor VIII, obtenida al final de la purificación mediante cromatografía de intercambio iónico se eluye en las condiciones disociantes de la etapa de disociación.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la solución de factor VIII de partida se obtiene mediante purificación previa de una fracción plasmática, especialmente de la fracción crioprecipitada del plasma, mediante precipitación con heparina.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la solución de factor VIII de partida está parcialmente desactivada víricamente mediante tratamiento con disolvente-detergente.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la solución de factor VIII de partida comprende un factor VIII inmunopurificado.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la solución de factor VIII de partida comprende factor VIII recombinante.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la solución de partida es de origen plasmático.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el factor VIII en la solución de partida tiene una actividad específica por lo menos igual a 50 UI/mg, preferentemente por lo menos igual a 100 UI/mg.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la concentración en factor VIII C de la solución de factor VIII de partida está comprendida entre 2 y 100 U/ml, preferentemente entre 10 y 50 U/ml.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el contenido de proteínas de la solución de factor de partida está comprendida entre aproximadamente 0, 05 y aproximadamente 0, 5 mg/ml, preferentemente entre aproximadamente 0, 1 y aproximadamente 0, 5 mg/ml.

19. Solución de factor VIII víricamente segura susceptible de ser obtenida mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

20. Solución según la reivindicación 19, como medicamento.

21. Solución según la reivindicación 20, como medicamento para el tratamiento de la hemofilia A.