INMUNOSENSOR ELECTROQUÍMICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA MICOTOXINA FB1.

Inmunosensor electroquímico para la determinación cuantitativa de la micotoxina FB1.

La presente invención se refiere a un kit que comprende un inmunosensor electroquímico para la determinación cuantitativa de la fumonisina B1. Se trata de un inmunosensor electroquímico competitivo directo, donde se utilizan anticuerpos específicos de la micotoxina FB1 inmovilizados sobre micropartículas magnéticas funcionalizadas con proteína G. La fumonisina B1 procedente de la muestra a analizar competirá con una fumonisina B1 marcada con peroxidasa de rábano picante (conjugado FB1-HRP) por un elemento de biorreconocimiento, que es el anticuerpo monoclonal inmovilizado sobre las partículas magnéticas. La etapa de la reacción enzimática y la detección electroquímica tienen lugar sobre un electrodo múltiple, preferiblemente de 8 electrodos serigrafiados de carbono, detectándose electroquímicamente los electrones generados tras la reacción enzimática. Además, la invención se refiere al método de detección y cuantificación electroquímico de la micotoxina fumonisina B1 (FB1) utilizando el kit y a su uso para la detección y cuantificación en cereales y productos derivados.

La presente invención se refiere a un kit que comprende un inmunosensor electroquímico 5 para la determinación cuantitativa de la fumonisina B1.

Además, la invención se refiere al método de detección y cuantificación electroquímico de la micotoxina fumonisina B1 (FB1) utilizando el kit y a su uso para la detección y cuantificación en cereales y productos derivados.

Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la química analítica y/o química 10 de los alimentos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los métodos desarrollados para la detección y determinación de la micotoxina fumonisina B1 (FB1), generalmente suelen emplear técnicas tales como la cromatografía en capa fina, cromatografía en capa fina de alta resolución, cromatografía líquido-líquido de alta 15 resolución, cromatografía de gases y finalmente los métodos de inmunoensayo [Ellen S. Kulisek and Jan P. Hazebroek, Comparison of Extraction Buffers for the Detection of Fumonisin B1 in Corn by Immunoassay and High-Performance Liquid Chromatography, J. Agrie. Food Chem., 48, 65-69, 2000.]. También se han empleado varias técnicas de espectrometría de masas (EM) con este fin.

Uno de los aspectos a tener en cuenta en la determinación cromatográfica de la FB1 es la necesidad de utilizar sistemas de revelado para su detección, lo que dificulta y alarga el procedimiento analítico.

El análisis por cromatografía de gases implica una hidrólisis inicial de la FB1. Una vez hidrolizada se han determinado los ácidos tricarboxílicos formados una vez esterificados con 25 isobutanol, si bien esto no permite la distinción entre los distintos tipos de fumonisinas. También se han analizado los aminopolioles de la hidrólisis, una vez formados sus derivados trimetilsililados (TMS) o trifluoroacetilados (TFA). En estos casos el aminopentol y aminotetraol originados respectivamente a partir de la FB1y FB2 pueden ser identificados muy bien por cromatografía de gases (CG) utilizando una columna capilar y un detector de

ionización de llama, existiendo variaciones con acoplamiento con un EM. De todas maneras, los derivados de TMS de la FB2 y de la FB3, dos aminotetraoles no han sido separados, mientras que los derivados de TFA, sólo se separan unos pocos segundos.

La espectrometría de masas (EM) y su acoplamiento con otro espectrómetro de masas (EM/EM), han sido también utilizados para la identificación de la FB1, previamente separados por cromatografía líquido-líquido [Aberg, Annica Tevell; Solyakov, Alexey; Bondesson, Ulf, Development and in-house validation of an LC-MS/MS method for the quantification of the mycotoxins deoxynivalenol, zearalenone, T-2 and HT-2 toxin, ochratoxin A and fumonisin B1 and B2 in vegetable animal feed, Food additives & contaminants. Part A, Chemistry, analysis, control, exposure & risk assessment, 30, 3, 541-549, 2013],

Cabe citar aquí también que se han desarrollado mediante ensayos enzimáticos de inmunoadsorción directa o indirecta, utilizando anticuerpos con una cierta reactividad sobre la FB1. El compuesto formado, basándose en anticuerpos monoclonales, se vio que servía para la realización de "screening" de piensos contaminados con una cantidad >5 pg/g de FB1 [Deng, Guozhe; Xu, Kun; Sun, Yue; et al, High Sensitive Immunoassay for Multiplex Mycotoxin Detection with Photonic Crystal Microsphere Suspensión Array, ANALYTICAL CHEMISTRY, 85, 5, 2833-2840, 2013],

Sin duda el método más empleado hasta la fecha para el análisis y cuantificación de la FB1 es la cromatografía líquido-líquido de alta resolución (HPLC). Ahora bien, como la FB1 no absorbe en la zona del espectro ultravioleta ni en la zona del visible, para su análisis por estos métodos, son necesarias técnicas de derivatización de las muestras que contengan esta micotoxina, lo que supone un encarecimiento del análisis, un aumento del tiempo de realización y también su coste económico [Kong, Weijun; Xie, Tingting; Li, Junyuan; et al, Analysis of fumonisins B-1 and B-2 in spices and aromatic and medicinal herbs by HPLC- FLD with on-line post-column derivatization and positive confirmation by LC-MS/MS, ANALYST, 137, 13, 3166-3174, 2012.].

La primera determinación cuantitativa de FB1 mediante HPLC comprendía una detección en el espectro de UV a 230 nm de los correspondientes derivados maléicos, y a pesar de que esta técnica da buenos resultados en el análisis de cultivos de hongos, no es suficientemente sensible para el análisis de las muestras contaminadas naturalmente.

Para mejorar esta sensibilidad se optó por la preparación de derivados fluorescentes.

Uno de los primeros reactivos empleados con este objetivo fue la fluorescamina. Este reaccionaba con el grupo NH2 de la FB1 produciendo dos picos como resultado de la formación de una mezcla en equilibrio entre los derivados ácido/alcohol y los lactónicos.

Un segundo reactivo introducido fue el o-ftaldialdehido (OPA). Este reactivo forma benzoderivados fluorescentes sobre la amina libre, los cuales presentan el inconveniente de que se degrada rápidamente con el tiempo (< 2 min). A pesar de esto es el reactivo actualmente más utilizado para este tipo de análisis. Se utiliza en estudios comparativos con métodos como el ELISA y CG-EM y también en estudios de puesta a punto de método de análisis oficiales a nivel internacional [Cun Li; Yin-Liang Wu; Ting Yang; et al, Rapid determination of fumonisins B1 and B2 in corn by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with ultrasonic extraction, Journal of Chromatographic Science, 50, 1, 57-63, 2012],

Otro reactivo usado es el naftalen-2,3-dicarboxialdehído (NDA), éste constituye una buena alternativa al OPA, siendo sus derivados significativamente más estables y con una mayor fluorescencia, propiedades muy útiles a la hora de automatizar las inyecciones de los derivados. Este compuesto reacciona con la amina primaria de la FB1 en presencia del ion cianuro para procurar la formación de benzoderivados. El principal inconveniente deriva de la necesidad de trabajar con KCN.

El uso de 4-fluoro-7-nitrobenzofurazano (NBF-F) para el análisis de FB1, con un tiempo de reacción de 1 min a 60 °C mejoró significativamente la sensibilidad del método permitiendo la detección de hasta 1 ng de FB1. La estabilidad depende de la calidad del reactivo mientras que su vida media es de sólo 20 min. En un estudio comparativo con derivados de naftalen-2,3-dicarboxialdehído (NDA-KCN) se obtuvieron respuestas muy similares en un mismo material contaminado naturalmente. Dando valores de FB1y FB2 de 1,7 y 0,50 pg/g y de 1,8 y 0,35 pg/g para (NBF-F) y (NDA-KCN) respectivamente.

En este tipo de métodos se aprovecha la presencia del grupo amino en la micotoxina FB1, al igual que ocurre en los métodos desarrollados para el análisis de aminoácidos. De ahí que la utilización de estos reactivos derivatizantes se haga imprescindible en los métodos cromatográficos, lo cual dificulta notablemente el análisis, debido, sobretodo, a su elevada inestabilidad, además también alarga el tiempo del ensayo.

La disponibilidad de anticuerpos para la FB1 hace posible el desarrollo de inmunosensores

para esta micotoxina, si bien su número es todavía muy escaso. Los inmunosensores más

empleados se basan en la resonancia de plasmón superficial (SPR), con límites de detección (LODs) del orden de 50 ng/g y EC50=720 ng/g, puede realizarse la medida en 15 minutos sin contar con el tratamiento de la muestra y el procedimiento analítico, y muestra buena correlación con GC-MS o HPLC-MS. Sin embargo, son necesarias columnas de 5 inmunoafinidad previamente a la determinación por SPR, y la instrumentación es compleja [Mullett, W; Lai, EPC; Yeung, JM, Immunoassay of fumonisins by a surface plasmon resonance biosensor, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 258, 2, 161-167, 1998].

También se han descrito baterías de microsensores basados en la fluorescencia evanescente, con LODs para la FB1 de 0,2 a 50 ng/g, polímeros de impresión molecular 10 (MIPs) para FB1, o dispositivos de flujo lateral [Lamberti, Ilaria; Tanzarella, Caterina; Solinas, Isabella; et al., An antibody-based microarray assay for the simultaneous detection of aflatoxin B1 and fumonisin B1, Mycotoxin research, 25, 4, 193-200, 2009]. Este tipo de dispositivos suelen tener una baja especificidad y una elevada reactividad cruzada con compuestos químicos semejantes que puedan estar presentes en la misma muestra.

Recientemente se ha descrito un biosensor quimiluminiscente para la determinación de FB1 en maíz, con un límite de detección de 2,5 ng/ml. La instrumentación de este biosensor es muy compleja [Mirasoli, Mara; Buragina, Angela; Dolci, Luisa Stella; et al., Chemiluminescence-based biosensor for... [Seguir leyendo]

I. Kit que comprende un anticuerpo monoclonal de la micotoxina FB1 inmovilizado sobre micropartículas magnéticas funcionalizadas con proteína G, un conjugado FB1-HRP que comprende la micotoxina FB1 unida a una enzima peroxidasa de rábano picante HRP,

un sustrato y un cosustrato enzimáticos de dicha enzima HRP que comprende hidroquinona y peróxido de hidrógeno, disolución tampón y un inmunosensor electroquímico que comprende un potenciostato portable, un electrodo múltiple, preferiblemente de 8 electrodos serigrafiados de carbono, un soporte y un sistema de imanes.

2. El kit, según la reivindicación 1, donde el anticuerpo monoclonal FB1 inmovilizado sobre

micropartículas magnéticas funcionalizadas con proteína G está en forma de suspensión en disolución tampón.

3. El kit, según la reivindicación anterior, donde el anticuerpo monoclonal FB1 tiene una concentración de entre 5 y 15 mg/l.

4. El kit, según la reivindicación anterior, donde el anticuerpo monoclonal FB1 tiene una

concentración de 10 mg/l.

5. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el conjugado FB1-HRP que comprende la micotoxina FB1 unida a una enzima peroxidasa de rábano picante HRP está diluido en la disolución tampón en una proporción 1 a 200.

6. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la cantidad de

micropartículas magnéticas necesarias está en un rango comprendido entre 5 y 10 pg.

7. El kit, según la reivindicación anterior, donde la cantidad de micropartículas magnéticas necesarias es de 5 pg.

8. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde las micropartículas

magnéticas tienen un diámetro de entre 2,5 pm y 3 pm.

9. El kit, según la reivindicación anterior, donde las micropartículas magnéticas tienen un diámetro de 2,8 pm.

10. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la disolución tampón es una disolución fosfato salina que se selecciona de la lista que comprende PBS, PBST o

cualquiera de sus combinaciones.

II. El kit, según la reivindicación anterior, donde la disolución tampón está a una concentración de 0,1 M.

12. El kit, según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde la disolución tampón se encuentra a un pH de entre 6.5 y 7.5.

13. El kit, según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 12 donde el soporte se selecciona de la lista que comprende una placa de microvaloración ELISA o soporte de plástico o cuentas.

14. Un método para determinar y cuantificar electroquímicamente la micotoxina FB1 en una 5 muestra utilizando el kit, según las reivindicaciones 1 a 13, que comprende las siguientes

etapas:

a) poner en contacto una muestra a analizar, diluida en disolución tampón, con una disolución de un conjugado enzimático FB1-HRP que comprende la micotoxina FB1 unida a una enzima peroxidasa de rábano picante HRP,

b) añadir una suspensión del anticuerpo monoclonal de FB1 inmovilizado sobre

micropartículas magnéticas funcionalizadas con proteína G en disolución tampón sobre la disolución obtenida en la etapa a),

c) agitar y aplicar un campo magnético mediante un sistema de imanes,

d) añadir la suspensión de la etapa c) sobre un electrodo múltiple, preferiblemente de

8 electrodos serigrafiados de carbono,

f) añadir una disolución de un sustrato y cosustrato enzimáticos de la enzima HRP que comprende hidroquinona y peróxido de hidrógeno, sobre la suspensión de la etapa d),

f) realizar la medida electroquímica.

15. El método, según la reivindicación anterior, donde la muestra a analizar procede de

muestras de cereales o productos derivados.

16. El método, según cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, donde las etapas (a), (b) y (c) se llevan a cabo en un soporte seleccionado de la lista que comprende una placa de microvaloración ELISA o soporte de plástico o cuentas.

17. El método, según la reivindicación anterior, que se lleva a cabo en una placa de

microvaloración ELISA.

18. El método, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, donde la medida electroquímica es una medida amperométrica.

19. El método, según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, donde la etapa (f) se realiza

a un potencial reductor de -0.35V.

20. Uso del kit, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para determinar y cuantificar la micotoxina FB1 en cereales y sus productos derivados.