Identificación de secuencias de ácidos nucleicos.

Un procedimiento para su uso en la detección de un ácido nucleico diana que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una sonda de ácido nucleico monocatenaria con una muestra de interés en condiciones eficaces para generar un duplo de sonda/ácido nucleico diana mediante la hibridación específica de dicha sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico diana, si dicho ácido nucleico diana está presente;

(ii) poner en contacto cualquier duplo de sonda/ácido nucleico diana con una exonucleasa para efectuar la digestión del duplo y la liberación de una molécula marcadora del duplo; y

(iii) detectar el marcador mediante espectroscopía Raman detectando un cambio detectable en el espectro Raman del marcador tras su liberación del duplo, para detectar el ácido nucleico diana, si está presente.

Identificación de secuencias de ácidos nucleicos

Esta invención se refiere a la identificación de secuencias de ácidos nucleicos. Más particularmente la invención se refiere al uso de una enzima exonucleasa para facilitar la identificación de una secuencia diana por medio de la degradación de un duplo de ácido nucleico formado entre una secuencia de ácido nucleico diana y una secuencia de sonda de ácido nucleico, de tal modo que se genera un cambio de señal discernible tras la degradación de la sonda cuando se une a/se asocia con la diana o el duplo de ácido nucleico, cuyo cambio de señal es detectable por medio de microscopía Raman.

Introducción

La industria moderna de diagnóstico molecular está valorada en 20 mil millones de £ y está creciendo a una tasa del 10% anual. Aunque se basa en una serie de técnicas distintas, este mercado en constante crecimiento está dominado por los enfoques basados en la amplificación (principalmente ensayos basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)). El motivo de esto es que el genoma de los organismos y ciertamente el de los seres humanos es particularmente complejo y necesita la simplificación de la región de interés para una enfermedad particular o un ensayo diagnóstico. Además de reducir la complejidad del genoma, un enfoque basado en la amplificación también aumenta la cantidad de material disponible para la detección. Esto es importante cuando se considera la biodisponibilidad y sensibilidad de las técnicas rutinarias tales como la fluorescencia o la quimioluminiscencia.

La PCR es una técnica de biología molecular usada para replicar y amplificar regiones específicas (o genes) de una cadena de ADN. Una pequeña cantidad de ADN puede amplificarse exponencialmente, sin usar un organismo vivo tal como una levadura o £ coli, para obtener suficiente ADN para que se ensaye adecuadamente. La técnica se usa para una serie de aplicaciones tales como la detección de enfermedades y estados patológicos infecciosos o hereditarios, la clonación de genes, ensayos de paternidad y huella genética en ciencias forenses.

El procedimiento de la PCR se lleva a cabo en ciclos. Cada ciclo consiste en tres etapas: desnaturalización, hibridación y extensión.

En la etapa de desnaturalización el molde de ADN bicatenario que contiene la región diana o el gen de interés que se amplificará se calienta para romper los enlaces de hidrógeno entre dos hebras. Esto hace que se separen y se vuelvan accesibles a los cebadores (secciones cortas de ADN o ARN que son complementarias al comienzo y al final de la región de ADN que se va a amplificar).

En la etapa de hibridación la temperatura disminuye, permitiendo que los cebadores hibriden con secuencias complementarias en el ADN diana, flanqueantes a la región que se va a amplificar. Dado que a menudo de usa un gran exceso de cebadores, las hebras diana se unen a los cebadores en lugar de hacerlo entre ellas mismas.

En la etapa de extensión, la ADN polimerasa (una enzima que sintetiza nuevas copias de la región de ADN de interés) copia la cadena de ADN comenzando en cada cebador y extiende las nuevas hebras en la dirección de 5 a 3. Esto da como resultado dos copias del ADN bicatenario que constituyen el molde para el siguiente ciclo. Por lo tanto, se replica una cantidad doble de ADN en cada nuevo ciclo. Un segundo ciclo produce 4 copias de una secuencia diana de ADN bicatenario. Después del tercer ciclo hay 8 copias de la secuencia diana de ADN bicatenario, dos de las cuales consisten solamente en la región diana. Las otras copias también incluyen las regiones de ADN flanqueantes. Se realizan de aproximadamente de 20 a 35 ciclos.

La PCR cuantitativa (QPCR), también mencionada como PCR en tiempo real, es una modificación de la PCR. Esta técnica se usa comúnmente para detectar una secuencia específica de ADN dentro de una muestra. Si la secuencia específica está presente, la QPCR puede medir rápidamente la cantidad de producto de PCR en tiempo real. Esta puede usarse para medir indirectamente la cantidad de material inicial presente. La mayor parte de los procedimientos de QPCR usan una molécula indicadora fluorescente que aumenta a medida que se acumula el producto de PCR con cada ciclo de amplificación.

Una de dichas técnicas es el procedimiento de SYRB Green. El colorante SYBR Green puede unir el nuevo ADN bicatenario sintetizado y puede medirse el aumento de la intensidad de fluorescencia. Esto permite determinar posteriormente la concentración inicial de ADN.

También se usan comúnmente sondas específicas de secuencia (por ejemplo, Sondas TaqMan o Balizas Moleculares) para la QPCR. Las sondas TaqMan están diseñadas para hibridar con una secuencia específica de ADN, habitualmente una sección del producto de PCR deseado. La sonda contiene un colorante indicador que es fluorescente. La sonda también contiene un desactivador, que absorbe la fluorescencia emitida por el colorante indicador. La proximidad cercana del desactivador con respecto al indicador impide la fluorescencia de este último. Durante la fase de extensión del ciclo de PCR, la actividad de exonucleasa de la ADN polimerasa permite que se "sobreescriba" sobre la sonda rompiéndola en fragmentos separados. Al hacer esto, la molécula desactivadora se separa del colorante indicador y aumenta la fluorescencia.

Las balizas moleculares actúan de un modo similar al de las sondas TaqMan. Las balizas moleculares son sondas con forma de horquillas que también contienen típicamente un par de fluoróforo/desactivador y que están diseñadas para detectar secuencias específicas de ADN. De nuevo, la proximidad cercana del desactivador impide la fluorescencia del fluoróforo. Cuando la sonda híbrida con una secuencia de nucleótidos complementaria, sin embargo, la sonda se endereza, introduciendo suficiente distancia entre el fluoróforo y el desactivador para que se dé la fluorescencia. No obstante, la detección de la fluorescencia está ligada a la sensibilidad y puede ser necesaria una señal fluorescente relativamente grande por encima del fondo con el fin de la detección exitosa con respecto al escaneo.

También se han usado sondas marcadas radiactivamente para detectar el ADN. Su uso fue ventajoso para permitir técnicas muy sensibles pero tenía la desventaja presentar una dificultad en el manejo y la eliminación segura de las sonda marcadas radiactivamente. Además, dichas técnicas no permitían los ensayos continuos (algunas veces mencionados como homogéneos) dado que era necesaria la separación del sustrato sin reaccionar antes de que pudiera hacerse alguna medición cuantitativa. Por lo tanto, dichas técnicas no se usan con la misma frecuencia que las técnicas modernas tales como aquellas que implican balizas moleculares y sondas TaqMan.

S.C. Hillier y col. notifican (Electrochemistry Communications, 6, 1227-1232 (2004)) un ensayo electroquímico de detección génica que utiliza la actividad de la exonucleasa T7 sobre secuencia complementaria de oligonucleótidos diana en la que se describe un procedimiento para detectar una secuencia específica de ADN usando una sonda marcada con ferroceno 5. La sonda híbrida con la región diana y después la exonucleasa T7, que muestra una actividad exonucleasa de 5 a 3 sobre el ADN bicatenario, escinde el nucleótido terminal del extremo 5 de la sonda liberando el ferroceno. El ferroceno liberado migra a la superficie del electrodo dando como resultado un aumento de la corriente de oxidación del ferroceno en el electrodo. Sin embargo, este ensayo no tiene ningún aspecto homogéneo ya que ninguna de las sondas no incorporadas o sin hibridar se separarían antes de la detección dado de otro modo que estas producirían una señal de fondo.

La Patente de EE.UU. N° 5.853.990 (Winger y col.) describe la determinación de una sonda de nucleótidos usando una sonda de ARN. Una sonda de ARN híbrida con una secuencia diana de ADN, la sonda de ARN se ha modificado de modo que contenga marcadores similares a los que se usan en el ensayo TaqMan. La enzima RNasaH se usa entonces para degradar selectivamente la cadena de ARN de la quimera de modo que se libera el marcador del desactivación

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el reconocimiento de la capacidad de determinadas exonucleasas para digerir un ácido nucleico bicatenario (es decir, duplo). Dicha capacidad de procesamiento permite que se proporcione un sistema por el cual puede liberarse una molécula de señalización tras la digestión del duplo de ácido nucleico y la molécula de señalización/marcador detectado por medio de espectroscopia Raman y en (R)DRSP particulares.

Visto desde un primer aspecto, por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para su uso en la detección de un ácido nucleico diana que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una sonda de ácido nucleico monocatenaria con una muestra de interés en condiciones eficaces para generar un duplo de sonda/ácido nucleico diana mediante la hibridación específica de dicha sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico diana, si dicho ácido nucleico diana está presente;

(ii) poner en contacto cualquier duplo de sonda/ácido nucleico diana con una exonucleasa para efectuar la digestión del duplo y la liberación de una molécula marcadora del duplo; y

(iii) detectar el marcador mediante espectroscopia Raman detectando un cambio detectable en el espectro Raman del marcador tras su liberación del duplo, para detectar el ácido nucleico diana, si está presente.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha exonucleasa no tiene capacidad de sintetizar oligonucleótidos; y/o en el que dicha sonda de ácido nucleico tiene un grupo fosfato 5 y dicha exonucleasa es exonucleasa lambda.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que se pone en contacto un exceso de dicha sonda de ácido nucleico con la muestra de interés en la etapa (i), de tal modo que la digestión de un duplo en la etapa (¡i) recicla el ácido nucleico diana una o más veces, permitiendo de este modo que moléculas de sonda adicionales hibriden específicamente con la diana formando duplos de sonda/ácido nucleico diana adicionales que se digieren para liberar moléculas diana adicionales.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de cualquier ácido nucleico diana en dicha muestra de interés se determina con referencia a la magnitud de dicho cambio.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sonda de ácido nucleico y/o el ácido nucleico diana es ADN.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho ácido nucleico diana es un ácido nucleico bicatenario o un ácido nucleico monocatenario.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador únicamente es capaz de detectarse por medio de espectroscopia Raman cuando se libera del duplo de ácido nucleico por medio de la digestión del duplo de sonda/ácido nucleico diana.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho marcador es un colorante activo para (R)DRPS; y/o en el que el marcador es un fluoróforo.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha sonda comprende un fluoróforo y un desactivador que extingue al fluoróforo antes de dicha digestión; y/o en el que dicha detección por espectrometría Raman se complementa por detección basada en plasmónica o fluorescencia.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia de la sonda se une a un sustrato activo de (R)DRPS.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sonda de ácidos nucleicos opcionalmente comprende de aproximadamente 20 a 30 nucleótidos.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el marcador se pone en contacto con dicha sonda de ácido nucleico y dicha muestra de interés en la etapa (i), cuyo marcador puede intercalarse con cualquiera de dichos duplos sonda/ácido nucleico diana si estos se forman.

13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el marcador está unido, enlazado o asociado de otro modo con la sonda de ácido nucleico, por ejemplo en el que la sonda de ácido nucleico está enlazada al marcador.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha puesta en contacto comprende poner en contacto con una primera sonda de ácido nucleico y con una segunda sonda de ácido nucleico, en el que dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una porción de dicho ácido nucleico diana, y un resto capturable, que permite la captura de cualquiera de los duplos resultantes de la hibridación de la primera sonda de ácido nucleico con el ácido nucleico diana, y en el que dicha segunda sonda comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una porción de dicho ácido nucleico diana distinta a la que es complementaria a dicha primera sonda de ácido nucleico y dicho marcador.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el duplo formado poniendo en contacto dicha muestra de interés con dichas primera y dicha segunda sonda de ácidos nucleicos se aísla de otro material que no forma parte de dicho duplo antes de dicha detección después de dicha puesta en contacto.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha puesta en contacto comprende poner en contacto con una primera sonda de ácido nucleico y con una segunda sonda de ácido nucleico, en el que

dicha primera sonda de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una porción de dicho ácido nucleico diana, y una secuencia de ácido nucleico complementaria a una porción de dicha segunda sonda de ácido nucleico.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicha puesta en contacto comprende además poner en 5 contacto con un ácido nucleico de captura, siendo dicho ácido nucleico de captura complementario a una porción de

dicho ácido nucleico diana al que dicha primera sonda de ácido nucleico no es complementaria y está enlazado a un resto capturable que permite la captura de cualquier complejo de ácido nucleico capturable, pudiéndose formar dicho complejo de ácido nucleico capturable tras dicha puesta en contacto cuando dicho ácido nucleico diana está presente, tal como en el que dicho complejo de ácido nucleico capturable está aislado de otro material que no es 10 parte de dicho duplo antes de dicha detección después de dicha puesta en contacto.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que el marcador está unido, enlazado o asociado de otro modo con la segunda sonda de ácido nucleico, por ejemplo en el que la segunda sonda de ácido nucleico es enlazada al marcador; y/o en el que la primera y la segunda sonda de ácidos nucleicos comprende, cada una de ellas, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleótidos.

15 19. Un procedimiento para detectar simultáneamente varios ácidos nucleicos diana distintos en una muestra de

interés que comprende efectuar simultáneamente varios procedimientos de acuerdo con los procedimientos que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en los que se usa un marcador distinto para detectar cada uno de dichos ácidos nucleicos diana.